雷公藤多甙对耐顺铂人上皮卵巢癌细胞体外活性的影响及机制研究①

占欣璐 谭布珍 钟焰英 刘文成 胡 辉 曹 青 何远桥

(南昌大学第二附属医院妇产科，南昌 334000)

卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫内膜癌，死亡率却居于首位。上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer，EOC)是卵巢癌中最主要的组织学类型，最大限度的肿瘤细胞减灭术以及术后紫杉醇和顺铂(DDP)为主的联合化疗方案是晚期上皮性卵巢癌的标准治疗方案，超过 25% 的患者在开始治疗后6个月复发[1]。由于化疗的高耐药率，晚期上皮性卵巢癌患者的5年复发率高达70%。研发新型靶向化疗药物或化疗增敏药物已成为研究热点。P13K/AKT信号通路在肿瘤细胞中呈激活状态，多项研究证明其与肿瘤多重耐药性高度相关，但其具体调控机制尚不明确。本课题组前期研究发现雷公藤内酯醇(TP)与DDP联合应用可促进人卵巢癌细胞凋亡，产生协同抗癌作用[2]。TP属于试验用品尚未应用于临床，是雷公藤多甙(Tripterygium Wilfordii Hook.F.,GTW)的主要活性成份。雷公藤多甙具有抗炎、免疫抑制的作用，是否具有和TP类似的抗肿瘤作用尚待研究。本研究在前期研究的基础上，集中探讨GTW对SKOV3/DDP细胞凋亡和细胞周期的影响及其与P13K/Akt/NF-κB信号通路的关系，从而为GTW应用于晚期耐药性卵巢癌提供更多证据。

1 材料与方法

1.1材料 SKOV3/DDP细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库；顺铂购于江苏豪森药业有限公司(国药准字：H20040813)；雷公藤多甙购于成都格力普公司；RMPI1640培养基、PBS购于北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清购于美国Gibco 公司；细胞周期试剂盒及Hoechst 33258染色试剂盒购于万类生物技术有限公司；总蛋白提取试剂盒及核蛋白提取试剂盒购于赛尔科学仪器有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购于北京普利莱基因技术有限公司；PI3K、T-Akt、IκBα、NF-κB、Bcl-2抗体购于美国Abcom公司；p-Akt(ser-473)购于美国Cell Signaling Technology公司；ECL发光试剂盒购于康为世纪有限公司 。

1.2方法

1.2.1药液配制及药物作用浓度的确定 用适量RPMI1640溶液将2 mg/ml的顺铂母液稀释至10 μg/ml的药液，包锡纸避光保存于-20℃冰箱备用。称取适量的雷公藤多苷药粉,先用适量二甲基亚砜(DMSO)将其溶解,用适量 RPMI1640将 DMSO浓度稀释至0.1%以下,配制为浓度为3 200 μg/ml的母液,包锡纸避光保存于-20℃ 冰箱备用，临用前将母液用RPMI1640培养基稀释成所需浓度。将不同浓度的GTW(0、50、200、800、1 600、3 200 μg/ml)分别处理SKOV3/DDP细胞24 h，CCK8法检测SKOV3/DDP细胞的存活率，利用半数抑制浓度(IC50)计算出IC50值为1 463 μg/ml，设置GTW低浓度为50 μg/ml，中浓度为800 μg/ml(接近IC50)，高浓度为3 200 μg/ml,进行药物干预实验。

1.2.2SKOV3/DDP细胞培养及实验分组 将人上皮性卵巢癌耐顺铂细胞株SKOV3/DDP培养于含0.5 μg/ml顺铂、10% 胎牛血清、青霉素和链霉素各100 U/ml的RPMI1640培养液中，接种于25 cm2培养瓶或6孔板中，于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内培养。1～2 d换液或传代1次，取对数期细胞进行后续实验。将细胞随机分为以下8组：RPMI1640组、10 μg/ml DDP组、50 μg/ml GTW组、800 μg/ml GTW组、3 200 μg/ml GTW组、10 μg/ml DDP+50 μg/ml GTW组、10 μg/ml DDP+800 μg/ml GTW组、10 μg/ml DDP+3 200 μg/ml GTW组。

1.2.3倒置相差显微镜下观察不同浓度GTW及DDP作用24 h后细胞形态学变化 以每孔约 9×106个细胞接种于6孔板中,约24 h后细胞融合度达40%～50%时，按照1.2.2中试验组药物度进行加药处理，药物作用24 h后在倒置相差显微镜下观察不同试验组SKOV3/DDP细胞形态的变化,并拍照记录。实验重复3次 。

1.2.4Hochest 33258染色法观察不同浓度GTW及DDP作用24 h后细胞形态学变化及细胞凋亡率 药物作用细胞24 h后，用PBS洗2～3遍,弃PBS,于暗室内避光将6孔板每孔中加入1 ml染色液,置于细胞培养箱中30 min。弃染色液,用PBS或培养液洗涤2～3次即可进行荧光检测。激发波长为350 nm,发射波长为460 nm。在倒置荧光显微镜下观察并拍照。于高倍镜下随机选取10个高倍视野，每个视野统计500个细胞中凋亡细胞数量,计算其平均值作为每组细胞的凋亡率。实验重复3次。

1.2.5流式细胞法检测不同浓度GTW及DDP作用24 h后细胞周期变化 药物作用细胞24 h后，用PBS洗2～3遍,弃PBS，用胰酶消化细胞,将消化好的细胞收集至离心管内,1 000 g 离心5 min,沉淀细胞;PBS重悬细胞并调整细胞浓度为1×106ml-1,1 000 g 离心5 min,沉淀细胞;加入1 ml 70%的冷乙醇固定过夜,染色前用预冷的PBS洗去固定液。加入100 μl RNase A,37℃水浴30 min;再加入500 μl Propidium Iodide 染色液混匀,4℃避光30 min。用流式仪检测分析,记录激发波长488 nm处荧光。实验重复3次。

1.2.6Western blot检测各组细胞PI3K、T-Akt、p-Akt(ser473)、IκBα、NF-κB、Bcl-2蛋白的表达 将约6×106个细胞接种于90 mm 培养皿中，显微镜下观察细胞，细胞密度及状态良好时，按照1.2.2中试验组药物浓度进行加药处理。收集药物处理24 h后的细胞，分别提取细胞总蛋白及细胞核蛋白；使用BCA蛋白定量试剂盒及酶标仪测出各组蛋白OD值，根据公式计算SDS的体积，将蛋白浓度调整至1 000 μg/ml 左右，加入6×loading buffer配成终浓度为1×的蛋白上样液；在EP管壁上标记各组组号，于沸水中煮10 min，置于-20℃冰箱中保存待用；配置6%或10%的分离胶及5%的浓缩胶，4℃冰箱过夜，将蛋白样品及蛋白Marker按顺序上样，细胞总蛋白上样量约20 μg、细胞核蛋白上样量约50 μg；以80 V 进行电泳，当蛋白Marker较分散时，调整电压为120 V;电泳结束后，以恒流260 mA进行转膜1.5 h；用TBST配制含10% Difco Skim Milk的封闭液，封闭2 h；漂洗PVDF膜，分别加入含兔抗人PI3K、T-Akt、p-Akt(ser473)、IκBα、NF-κB、Bcl-2、鼠抗人GAPDH、Histone H3的抗体袋中(一抗稀释比例为1∶1 000)，4℃反应过夜；将PVDF膜用TBST洗膜 10 min×3次；用10%脱脂奶粉封闭液配置含羊抗兔、羊抗鼠的二抗孵育液(二抗稀释比例为1∶10 000)，于室温孵育1 h；将PVDF膜用TBST洗膜10 min×3次；采用ECL发光试剂，使用图像采集仪内成像，条带分析应用Quantity One图像分析软件。总蛋白内参为GAPDH、核蛋白内参为Histone H3。实验重复 3 次。

2 结果

2.1不同浓度GTW及DDP作用24 h后细胞形态学变化

2.1.1倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化 药物作用24 h，与空白对照组及DDP组相比药物组可见部分细胞发生凋亡样改变：细胞皱缩、伪足消失、细胞由短梭形变为圆形、细胞核染色质浓缩，并可见坏死细胞脱落漂浮于培养基上；DDP组与空白对照组相较无明显差异；单药组及药物联合组与空白对照组相比，发生凋亡样改变的细胞明显增多，且随药物浓度增高而增多；药物联合组发生凋亡样改变的细胞均多于相应单药组，见图1。

图1 倒置显微镜下观察不同药物组作用24 h后SKOV3/DDP细胞的形态学变化(×400)Fig.1 Morphological changes of different drug groups on SKOV3/DDP cells after 24 h under inverted microscope (×400)Note:A.RPMI1640;B.10 μg/ml DDP;C.50 μg/ml GTW;D.800 μg/ml GTW;E.3 200 μg/ml GTW;F.10 μg/ml DDP+50 μg/ml GTW;G. 10 μg/ml DDP+800 μg/ml GTW;H.10 μg/ml DDP+3 200 μg/ml GTW.

2.1.2荧光显微镜下观察细胞形态学变化 药物作用24 h后，荧光倒置显微镜下观察发现，空白对照组细胞及DDP组细胞状态良好，伪足清晰，淡染、偶可见少量致密浓染细胞；药物组细胞变小、细胞核内染色质高度浓缩、凝集、可见细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体；单药组及药物联合组与空白对照组相比较，浓染细胞明显增多，且随药物浓度升高而增加；药物联合组浓染细胞均多于相应单药组，见图2。

2.2不同浓度GTW及DDP作用24 h后各组平均凋亡率 Hochest染色实验结果显示，10 μg/ml DDP组凋亡率(3.33±0.61)%及50 μg/ml GTW组凋亡率(4.27±0.66)%与空白对照组细胞凋亡率(2.20±0.20)%相比差异无显著统计学意义(P>0.05),800 μg/ml GTW组凋亡率(9.67±0.70)%及3 200 μg/ml GTW组凋亡率(17.60±1.20)%与空白对照组凋亡率相比差异均有显著统计学意义(P<0.001)，单药组凋亡率呈浓度依赖性(P<0.05);10 μg/ml DDP+50 μg/ml GTW组凋亡率(18.27±1.01)%、10 μg/ml DDP+800 μg/ml GTW组凋亡率(24.20±0.80)%及10 μg/ml DDP+3 200 μg/ml GTW组凋亡率(38.33±0.50)%与空白对照组凋亡率相比较，凋亡率明显升高(P<0.001),药物联合组凋亡率均呈浓度依赖性；各药物联合组与相应单药组相比凋亡率明显升高(P<0.001),见图3。

图2 Hochest 33258染色观察不同药物组作用24 h后细胞的形态学变化(×200)Fig.2 Morphological changes of different drug groups on SKOV3/DDP cells after 24 h by ochest 33258(×200)Note:A.RPMI1640;B.10 μg/ml DDP;C.50 μg/ml GTW;D.800 μg/ml GTW;E.3 200 μg/ml GTW;F.10 μg/ml DDP+50 μg/ml GTW;G.10 μg/ml DDP+800 μg/ml GTW;H.10 μg/ml DDP+3 200 μg/ml GTW.

图3 不同药物组对 SKOV3/DDP 细胞凋亡率的影响Fig.3 Effect of apoptosis rate of different drug groups on SKOV3/DDP cellsNote:▲.P<0.05;***.P<0.001.

图4 流式细胞仪检测不同药物组作用24 h后细胞周期变化Fig.4 Cell cycle changes of different drug groups on SKOV3/DDP cells after 24 h by flow cytometryNote:A.RPMI1640;B.10 μg/ml DDP;C.50 μg/ml GTW;D.800 μg/ml GTW;E.3 200 μg/ml GTW;F.10 μg/ml DDP+50 μg/ml GTW;G.10 μg/ml DDP+800 μg/ml GTW;H.10 μg/ml DDP+3 200 μg/ml GTW.

图5 不同药物组对SKOV3/DDP细胞周期中S期比例的影响Fig.5 Effects of different drug groups on cell cycle S phase ratio in SKOV3/DDP cellsNote:▲.P<0.05;***.P<0.001.

2.3不同浓度GTW及DDP作用24 h后各组细胞周期变化 图4所示，单用GTW、GTW联合DDP均可使耐药性卵巢癌细胞SKOV3/DDP发生S期阻滞。10 μg/ml DDP组S期细胞比例(24.24±2.40)%与空白对照组(19.34±2.83)%相比无明显差异(P>0.05),50 μg/ml GTW组S期细胞比例(37.23±0.97)%、800 μg/ml GTW组(38.86±1.71)%、3 200 μg/ml GTW组(43.40±2.09)%、10 μg/ml DDP+50 μg/ml GTW组(51.51±0.82)%、10 μg/ml DDP+800 μg/ml GTW组(53.10±0.48)%及10 μg/ml DDP+3 200 μg/ml GTW组(59.52±2.34)%与空白对照组相比明显升高(P<0.001);药物联合组S期细胞比例与相应单药组相比明显升高(P<0.001)；各组S期细胞比例升高程度呈浓度依赖性(P<0.05),见图5。

2.4不同浓度GTW及DDP作用24 h后各组细胞PI3K、T-Akt、p-Akt(ser473)、 IκBα、NF-κB、Bcl-2蛋白的表达 Western blot结果显示：各组细胞PI3K、T-Akt、IκBα蛋白表达一致，无明显差异；p-Akt(ser473)、NF-κB、Bcl-2蛋白的表达随GTW浓度升高，总体呈下降趋势(P<0.05),GTW与DDP联合组表达量显著低于相应单用GTW的药物组(P<0.05)。其中p-Akt(ser473)蛋白在800 μg/ml GTW组、3 200 μg/ml GTW组、10 μg/ml DDP+50 μg/ml GTW组、10 μg/ml DDP+800 μg/ml GTW组、 10 μg/ml DDP+3 200 μg/ml GTW组相对表达量均较空白对照组降低(P<0.05)，药物联合组蛋白相对表达量与相应单药组相比较均明显降低(P<0.01);NF-κB蛋白在800 μg/ml GTW组、3 200 μg/ml GTW组、10 μg/ml DDP+50 μg/ml GTW组、10 μg/ml DDP+800 μg/ml GTW组、 10 μg/ml DDP+3 200 μg/ml GTW组相对表达量均较空白对照组降低(P<0.05)，其中药物联合组蛋白相对表达量与相应单药组相比较均降低(P<0.05)；Bcl-2蛋白在10 μg/ml DDP组、10 μg/ml DDP+50 μg/ml GTW组、10 μg/ml DDP+800 μg/ml GTW组、10 μg/ml DDP+3 200 μg/ml GTW组相对表达量较空白对照组降低(P<0.05)，其中800 μg/ml GTW组与10 μg/ml DDP+800 μg/ml GTW组、3 200 μg/ml GTW组与10 μg/ml DDP+3 200 μg/ml GTW相对表达量比较显著降低(P<0.01)，见图6。

图6 不同药物组对SKOV3/DDP细胞内PI3K/AKT/NF-κB信号通路的影响Fig.6 Effects of different drug groups on PI3K/AKT/NF-κB signaling pathway in SKOV3/DDP cellsNote:A.RPMI1640;B.10 μg/ml DDP;C.50 μg/ml GTW;D.800 μg/ml GTW;E.3 200 μg/ml GTW;F;10 μg/ml DDP+50 μg/ml GTW;G.10 μg/ml DDP+800 μg/ml GTW;H.10 μg/ml DDP+3 200 μg/ml GTW.Compared with control group,▲.P<0.05,*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001.

3 讨论

肿瘤的多重耐药性是晚期上皮性卵巢癌患者化疗失败的主要原因，近年来，寻求新型化疗药物或提高化疗敏感性已成为研究热点。雷公藤多甙是一种从雷公藤根部提取的脂溶性混合物[3]，雷公藤甲素(TP)[4-6]、雷公藤红素及雷公藤氯内酯醇是其公认的抗癌抗炎活性成份。在我国，TP仅被允许作为实验用品应用于科研，以其为主要活性成份的GTW在临床上广泛应用于类风湿性关节炎、慢性肾炎和自身免疫性皮肤病，具有抗炎及免疫抑制作用，安全可靠。近年来多项研究发现，GTW具有抗肿瘤的作用。Wang等[7]通过体内外试验研究发现雷公藤多甙可克服前列腺癌多西他赛耐药并抑制前列腺肿瘤的生长。Zhou等[8]通过体外结合实验和酶活性技术发现了雷公藤提取物对宫颈癌Hela细胞作用的特殊靶点。雷公藤多甙是否可抑制耐药性卵巢癌尚待研究。

本研究选取不同浓度的GTW单药、顺铂和GTW联合给药作用于人顺铂耐药卵巢癌细胞SKOV3/DDP，结果发现，一定浓度的GTW有诱导耐药性卵巢癌细胞凋亡的作用，随浓度增加诱导凋亡作用也增强；且GTW有明显的化疗增敏作用，与顺铂联用时诱导凋亡作用显著增强。细胞周期是细胞最基本的生命活动，分为G1、 S、G2、M、G0期，肿瘤细胞中G0期～S期的细胞周期进程加快,细胞DNA合成加速,从而使细胞出现恶性增殖，继而导致癌症的发生。多种化疗药物及辅助化疗药物的作用机制为使肿瘤细胞阻滞于不同细胞周期继而诱发细胞程序性死亡。Zhang等[9]研究发现芦荟苦素可将卵巢癌细胞周期阻滞于S期，诱导SKOV3细胞凋亡，抑制肿瘤生长。Qu等[10]发现葫芦素B可将对紫杉醇耐药的卵巢癌A2780/Taxol细胞周期阻滞于G2/M期，可用于紫杉醇耐药卵巢癌的辅助治疗。已有研究表明[11]，顺铂可使SKOV3/DDP细胞阻滞于S期。本研究结果中单用顺铂组细胞周期与空白对照组相比无统计学差异，但顺铂与GTW联合组与单用GTW的药物组相比较，S期细胞比例明显升高(P<0.001)，提示低剂量顺铂与GTW连用可显著增强GTW的细胞周期阻滞作用。

PI3K/Akt信号通路广泛存在于细胞中，与多种肿瘤的发生和发展相关[12]。本课题组前期研究发现[4]，耐药性卵巢癌SKOV3/DDP细胞株中PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达量均高于卵巢癌SKOV3细胞株，差异有统计学意义，证明该通路在上皮性卵巢癌细胞中过度激活，并与肿瘤的耐药性关系密切。使用该通路靶向抑制剂LY294002可显著提高耐药性肝癌细胞、耐药性卵巢癌细胞、耐药性非小细胞肺癌细胞、耐药性乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性[13-15]。该通路被激活后，PI3K处于持续活化状态，Akt磷酸化后的活性形式(p-Akt)可促进肿瘤细胞生长、增殖;抑制细胞凋亡;促进细胞侵袭、转移;促进其对化疗和放疗的抵抗。NF-κB是Akt最重要的下游分子之一,它是p50、p65结合而成的异源二聚体，在多种细胞中都处于非活化状态。 NF-κB二聚体与IκB蛋白结合，掩盖其核定位信号，被固定于胞质中。典型的IκB蛋白包括IκBα、IκBβ、IκBε，其中IκBα是NF-κB活化过程中最强的负反馈因子，在经典信号通路激活时，IκBα可迅速降解，释放出NF-κB入核。Bcl-2是Akt下游效应分子中公认的抑制凋亡的原癌基因,在肿瘤的发生发展中发挥重要作用,现认为Bcl-2 的过表达是一些肿瘤产生耐药性的机制之一[16]。 Baekelandt 等[17]发现 Bcl-2 与化疗的原发抗药性密切相关,并预测Bcl-2 对卵巢上皮性肿瘤有抗铂类作用。本研究使用Western blot法检测了PI3K/Akt信号通路中的关键因子PI3K、T-Akt、p-Akt(ser473)、 IκBα、NF-κB、Bcl-2，其中p-Akt、NF-κB、Bcl-2表达水平在试验组给药后显著降低，引起级联放大效应，诱导细胞凋亡。其中800 μg/ml GTW组、3 200 μg/ml GTW组、10 μg/ml DDP+50 μg/ml GTW组、10 μg/ml DDP+800 μg/ml GTW组、10 μg/ml DDP+3 200 μg/ml GTW组与空白对照组相较明显下调(P<0.05);GTW单药组与相应药物联合组相比较，下降程度差异均有显著统计学意义(P<0.05)；单药组及药物联合组之间，下降程度呈浓度依赖性(P<0.05)，由此可见GTW可通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路，下调p-Akt、NF-κB、Bcl-2等信号因子的表达，进而诱导耐药卵巢癌细胞凋亡，协同增加耐药卵巢癌细胞对DDP的敏感性，且GTW浓度越高，增敏作用越明显。

综上所述，本研究结果表明一定浓度的GTW可明显诱导人耐药性卵巢癌SKOV3/DDP细胞凋亡，且GTW与低剂量的DDP联用有明显的化疗增敏作用，其机制与诱导细胞S期阻滞，抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路，下调p-Akt、NF-κB、Bcl-2等抑凋亡因子表达有关。雷公藤多甙已广泛应用于临床，具有副作用温和、价格低廉等优点，是一种有望应用于耐药性卵巢癌治疗的化疗药物和顺铂增敏药物。