下调MARCH8基因的表达对宫颈癌Siha细胞侵袭、迁移与增殖的影响①

陈禹宏 孟 莹 胡丽娜

(重庆医科大学附属第二医院妇产科，重庆 400010)

宫颈癌是全球女性中仅次于乳腺癌的最常见的妇科恶性肿瘤，是发展中国家妇女的主要死亡原因之一，其发病率居女性生殖道恶性肿瘤的首位[1-3]。Wnt/β-catenin信号通路是细胞内重要的信号转导通路之一，在调节正常细胞生长、运动、分化以及肿瘤的发生发展过程中都发挥着重要作用。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路中关键分子，Wnt/β-catenin信号通路的活化由细胞胞质中β-catenin的蛋白水平决定[4-6]。MARCH8(Membrane-associated RING-CH 8)是具有特定环指结构域的膜相关RING-CH家族的一员。MARCH8包含两个跨膜区和一个位于胞浆端的特定环指结构域，在人的多种正常组织中均有表达，并且在人体免疫系统中有重要作用。据研究，过度表达MARCH8将导致一些细胞黏附分子和抗原递呈分子的表达下调，这其中包括CD44、CD88、MHCⅡ和CD166等[7-9]。然而，在MARCH8对宫颈癌细胞生物学行为的影响和可能的作用机制方面，尚未见报道。为进一步探索MARCH8与宫颈癌的关系，本研究首次探讨了MARCH8基因对宫颈癌细胞侵袭、迁移、增殖和克隆能力的影响及其可能的作用机制，以期为宫颈癌发生机制的探究与新的分子靶点的治疗提供一定的研究基础。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器 胎牛血清和RPMI1640基础培养基购自美国Gibco公司。全RNA快速提取试剂盒购自北京百泰克公司。RNA逆转录试剂盒和SYBR-Green RT-PCR reaction mix试剂盒购自美国Bio-Rad公司。转染试剂盒购自上海吉玛制药技术有限公司。Transwell小室购自美国Corning公司。CCK-8试剂盒、ECL试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。PVDF膜购自美国Millipore公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人宫颈癌Siha细胞购自中国典型培养物保藏中心。 宫颈癌Siha细胞用完全培养液(含有10%胎牛血清和1%青链霉素的RPMI1640培养基)进行培养。细胞放置于温度37℃、CO2体积分数为5%的恒温孵箱中培养，并常规传代。

1.2.2siRNA转染至Siha细胞 取对数生长期的宫颈癌Siha细胞，接种于6孔板中，用不含青链霉素的完全培养液培养，待细胞融合度为50%左右时，按转染试剂盒中的说明书将siRNA-MARCH8和siRNA-NC转染至宫颈癌Siha细胞中。

1.2.3Transwell法 收集siRNA-MARCH8和siRNA-NC转染48 h后的宫颈癌Siha细胞，接种于24孔板里的Transwell小室上室中，每孔细胞数约为1.0×105个。将200 μl无血清培养基加入至Transwell小室的上室，500 μl完全培养液加入至下室中，而后37℃培养48 h。取出24孔板，将膜的下表面细胞用4%多聚甲醛固定15 min后，用0.5%结晶紫进行染色。待干后，在倒置显微镜中进行拍照，并且随机选取3个视野，计算侵袭后的平均细胞数。

1.2.4划痕愈合实验 收集siRNA-MARCH8和siRNA-NC转染48 h后的宫颈癌Siha细胞接种于6孔板中，待培养至细胞融合度为100%时，用移液器枪头均匀地画出3条直线。用PBS液洗3次后，加入1%血清培养基，在倒置显微镜中拍照，测定0 h时划痕的宽度。而后37℃培养48 h时，终止培养，并在倒置显微镜中拍照。

1.2.5CCK8 收集siRNA-MARCH8和siRNA-NC转染48 h后的宫颈癌Siha细胞，接种于96孔板中，每孔细胞数约为2.0×103个。待细胞培养至1、2、3、4 d后，加入CCK-8溶液10 μl,继续培养1 h后，450 nm处检测各孔的吸光度(D)值。

1.2.6细胞克隆法 收集siRNA-MARCH8和siRNA-NC转染48 h后的宫颈癌Siha细胞，接种于6孔板中，每个孔约1 000个细胞，置于温度37℃，CO2体积分数为5%的恒温孵箱中培养14 d，中间每隔4 d换一次完全培养液。待培养至14 d时，肉眼可见形成的细胞集落。终止培养，用4%多聚甲醛固定15 min后，用0.5%结晶紫进行染色。待干后，在显微镜下观察。

1.2.7Real-time PCR 收集siRNA-MARCH8和siRNA-NC转染后的宫颈癌Siha细胞，用全RNA快速提取试剂盒提取细胞总的RNA，并检测RNA纯度。采用RNA逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。随后，依据试剂盒说明，以合成的cDNA为模板，扩增目的基因。

1.2.8蛋白质印迹法 收集细胞，按照试剂说明书提取细胞总蛋白质，并用BCA法测定蛋白浓度。按照凝胶试剂盒说明书制备好凝胶后，进行SDS-PAGE以分离蛋白，通过电转将蛋白转至PVDF膜后，用5%的脱脂奶粉在室温下封闭2 h，加入一抗后并放置于4℃冰箱中过夜。随后加入二抗，在室温下孵育2 h。最后进行显色。

2 结果

2.1siRNA-MARCH8转染后Siha细胞中MARCH8的表达下调 Real-time PCR结果(图1A)和蛋白质印迹法结果(图1B)显示，与转入siRNA-NC组相比，转入siRNA1-MARCH8组和siRNA2-MARCH8组细胞中MARCH8 mRNA和蛋白表达水平均明显下降(P值均<0.05)。以上结果说明，siRNA-MARCH8对宫颈癌Siha细胞的转染是有效的，能成功降低细胞中MARCH8 mRNA和蛋白表达水平，其中，siRNA1-MARCH8的转染效率更好，因此后续实验用siRNA1-MARCH8对细胞进行转染。

2.2下调MARCH8表达对宫颈癌Siha细胞的侵袭、增殖以及迁移能力的影响 Transwell实验检测结果显示(图2A)，与转入siRNA-NC组相比，转入siRNA1-MARCH8组穿过小室膜的细胞明显减少(P<0.05)。CCK8结果显示(图2B),培养细胞至第2天时，转入siRNA1-MARCH8组的细胞生长速度明显低于转入siRNA-NC组。在培养至第3天，第4天时，转入siRNA1-MARCH8组与阴性对照组细胞生长速度仍有明显差异，差异有统计学意义(P<0.05)。划痕实验结果显示(图2C)，划痕48 h后，转入siRNA1-MARCH8组划痕仍然明显，而转入siRNA-NC组划痕宽度明显减小(P<0.05)。克隆实验结果显示(图2D)，与转入siRNA-NC组细胞相比，转入siRNA1-MARCH8组细胞形成克隆数明显降低(P<0.05)。以上结果说明下调MARCH8表达后，细胞侵袭、迁移、增殖和克隆形成能力均明显降低。

图1 siRNA-MARCH8转染后MARCH8 在mRNA和蛋白水平上的表达情况Fig.1 Expression of MARCH8 at mRNA level and at protein level after transfection of MARCH8Note:A.The expression of MARCH8 at mRNA level in cervical cancer Siha cells,*.P<0.05,vs siRNA-NC group；B.The expression of MARCH8 at protein level in Siha cells.

2.3下调MARCH8表达对宫颈癌Siha细胞中侵袭标记蛋白和增殖标记蛋白的影响 采用蛋白质印迹法探索下调MARCH8表达后对宫颈癌Siha细胞中侵袭标记蛋白MMP9、Vimentin和增殖标记蛋白PCNA的影响。结果显示(图3)，转入siRNA1-MARCH8组的细胞与转入siRNA-NC组细胞相比，MMP9蛋白、Vimentin蛋白和PCNA蛋白的表达均明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图2 下调MARCH8表达后对宫颈癌Siha细胞侵袭，增殖、 迁移以及细胞克隆能力的影响Fig.2 Effect of down-regulation of MARCH8 on invasion，proliferation，migration and cell forming clone ability in cervical cancer Siha cellsNote:A.Transwell assay was used to detect the invasion of Siha cells；B.Scratch assay was used to detect the migration of Siha cells；C.CCK8 assay was used to detect the proliferation of Siha cells；D.Cell clone assay was used to detect the cell forming clone ability of Siha cells.*.P<0.05,vs siRNA-NC group.

图3 下调MARCH8表达后对宫颈癌Siha细胞中MMP9蛋白、Vimentin蛋白和PCNA蛋白的影响Fig.3 Effect of down-regulation of MARCH8 on expression of MMP9，Vimentin and PCNA in cervical cancer Siha cellsNote:Expression of MMP9,Vimentin and PCNA was detected by Western blot.

图4 下调MARCH8表达对宫颈癌Siha细胞中β-catenin和E-cadherin蛋白表达水平的影响Fig.4 Effect of down-regulation of MARCH8 on expression of β-catenin and E-cadherin in cervical cancer Siha cellsNote:Expression of β-catenin and E-cadherin was detected by Western blot.

2.4下调MARCH8表达对宫颈癌Siha细胞中β-catenin蛋白与E-cadherin蛋白表达的影响 蛋白质印迹法实验结果显示(图4)，转入siRNA1-MARCH8组的细胞与转入siRNA-NC组细胞相比，β-catenin蛋白表达水平明显降低，而E-cadherin蛋白表达水平明显升高，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。

3 讨论

宫颈癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤之一，近年来由于宫颈癌筛查技术的推广，大多数患有早期肿瘤的妇女可以被早诊断早治疗，使宫颈癌的发病率和死亡率均有所下降。但随着高危型人乳头状病毒感染的增加，使得目前宫颈癌的发病率呈现年轻化[10,11]。因此，从分子水平上探讨宫颈癌的发生发展机制对宫颈癌的诊断和治疗都有非常重要的意义。

近年来，肿瘤免疫治疗因其显著的疗效和创新性备受关注，是肿瘤治疗中最具前景的测定研究方向之一[12,13]。其中众多免疫相关分子都发现对肿瘤的侵袭，迁移有着重要影响，如MMP-9[14]，BANCR[15]。MARCH8基因在人体免疫系统中也发挥着重要作用，据研究，过度表达MARCH8将导致一些细胞黏附分子和抗原递呈分子的表达下调，这其中包括CD44、CD88、MHCⅡ和CD166等[7,16]。因此，猜测MARCH8基因在肿瘤侵袭、迁移方面也可能发挥一定的作用。

据研究表明，MARCH8基因与生物发生发展过程具有密切联系，其基因表达的下调或者过表达都可导致异常发育[17]。MARCH1，与MARCH8同属于膜相关环指结构域家族的一员，已被证明其基因的表达与卵巢癌的发生发展有一定的关系[18]，且有研究发现，MARCH8在食管癌中低表达，沉默MARCH8后，食管癌细胞的侵袭、迁移以及增殖能力都被抑制[19]，但MARCH8在宫颈癌中的作用还未有文献报道。因此，为了探讨MARCH8对宫颈癌细胞的生物学行为的影响，本研究首先通过脂质体介导的方式将特异性靶向MARCH8基因的siRNA-MARCH8和阴性对照组siRNA-NC转染至宫颈癌Siha细胞中，并利用Real-time PCR和蛋白质印迹法证实转染成功。随后，采用Transwell小室法，划痕愈合实验，CCK-8实验以及细胞平板克隆实验分别检测下调MARCH8表达对宫颈癌细胞侵袭、迁移和增殖能力的影响。MMP9、Vimentin和PCNA蛋白与肿瘤的侵袭增殖密切相关，据研究发现，MMP9、Vimentin和PCNA蛋白的表达下调能够分别抑制肿瘤细胞的侵袭和增殖能力[20-22]，因此，我们再通过蛋白质印迹法检测下调MARCH8表达对宫颈癌细胞Siha中侵袭标记蛋白MMP9蛋白和Vimentin蛋白的影响，结果发现，下调MARCH8表达后，宫颈癌Siha细胞的侵袭、迁移、增殖和克隆形成能力均明显降低，MMP9、Vimentin和PCNA蛋白的表达也明显下降，这一结果跟侵袭增殖能力下降是相一致的。由此可见，在宫颈癌的发生发展过程中，MARCH8基因可能起着促进肿瘤形成和发育的作用。

Wnt/β-catenin信号通路在生物发育、细胞转运以及细胞凋亡等生命过程中发挥着巨大作用,其异常活化与多种肿瘤的发生、发展有关。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路中的关键分子，其在细胞质中累积到一定程度后，移位到细胞核中进而激活胞核中的下游信号分子。β-catenin能通过E-cadherin蛋白连接到细胞骨架的肌动蛋白上，并且E-cadherin蛋白的缺失会增加肿瘤的发生，对肿瘤的侵袭和转移也有影响[23，24]。因此，为了研究MARCH8促进宫颈癌的发生发展是否与Wnt/β-catenin信号通路有关，本研究在成功下调MARCH8基因表达后，采用蛋白质印迹法检测β-catenin和E-cadherin蛋白表达水平的变化。结果表明，β-catenin表达水平在下调MARCH8基因表达后明显降低，而E-cadherin表达水平则明显升高。因此，可以推测，下调MARCH8基因后导致的β-catenin蛋白表达水平降低可能是通过E-cadherin蛋白表达水平的升高来实现的，进而抑制Wnt/β-catenin通路后，对宫颈癌细胞的生物学行为发挥抑制的作用。

综上所述，MARCH8在宫颈癌中发挥着促进肿瘤发生发展的重大作用，且这一过程可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。