Diascie ProBact全自动微生物分离培养系统临床应用评估

郑 恬，徐修礼，白 露，周 柯，陈 潇，郝晓柯

（第四军医大学西京医院检验科，陕西 西安 710032）

随着科技的发展，临床基础检验、免疫学、生物化学等检测方法均已实现全自动化样本前处理，而微生物检验却一直延续传统的手工划线接种方式[1]。微生物全自动前处理系统在微生物检验的自动化中发挥了重要作用，既减少了差错率，增加了生物安全，为样本的接种提供了标准化的操作平台，又减轻了检验人员工作强度，使其从重复、繁琐的操作中解放出来，致力于检验后程序的质量控制，保证检测结果准确和可靠[2-3]。目前，市场上的全自动微生物流水线几乎均为国外公司生产，如意大利Copan公司的Copan Wasp全自动微生物前处理系统（简称Copan Wasp）、法国生物梅里埃公司的PREVI Isola系统及美国BD公司的Innova系统等[4-5]。第四军医大学西京医院检验科于2014年在国内率先引进了Copan Wasp，通过自定义系统参数优化设置样本处理方案，并接入实验室信息系统，利用条形码技术对样本进行自动化接种划线。目前，国产全自动微生物分离培养系统已研发成功，本研究就该仪器临床标本分离培养效果与Copan Wasp及手工法进行比对，评估其在临床中的应用价值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源 收集第四军医大学西京医院各病区的痰样本和中段尿样本各50例。

1.1.2 仪器 国产Diascie ProBact全自动微生物分离培养系统（简称Diascie ProBact）由武汉迪艾斯科技公司生产，Copan Wasp由意大利Copan公司生产，VITEK MS质谱鉴定系统由法国生物梅里埃公司生产。

1.1.3 试剂 痰液消化剂Sputasol由英国Oxoid公司生产，无菌痰管Copan12及挑痰棒由意大利Copan公司生产，VITEK MS基质液及靶板由法国生物梅里埃公司生产，血平板、含万古霉素巧克力平板和麦康凯平板由郑州安图公司生产，专用分离培养装置由武汉迪艾斯科技公司生产。

1.2 方法

1.2.1 样本的前处理及接种 （1）Diascie ProBact。该系统由自动化样本预处理振荡仪、专用分离培养装置、自动化细菌分离培养仪组成。首先使用专用样本采集杯采集样本，放入样本预处理样本盘内，对痰液样本进行振荡消化预处理20 min，中段尿样本不需特殊处理。然后将预处理后的样本悬液转移至专用分离培养装置（装置由培养基、培养基架、样本池和1 μL接种环组成）内，根据不同样本类型设置方案，选择不同的培养基组合和划线方式上机进行接种划线及培养。本研究痰样本接种选择血平板、万古霉素巧克力平板和麦康凯平板的培养基组合，中段尿样本接种选择血平板和麦康凯平板的培养基组合。（2）Copan Wasp。在Copan12无菌痰管中各加入1 mL提前配制好的10%溶痰剂，使用挑痰棒挑取痰样本中可疑部分，放入已加溶痰剂的痰管中，常温下放置10 min，随后上机自动依据设置的方案进行接种划线；中段尿样本则需要倒入特定的尿杯中贴好条码，再上机进行接种划线。（3）手工法。该操作由同一位操作熟练的检验人员完成。痰样本用痰消化液常温下消化10 min，混匀后用无菌棉签沾取，涂布于血平板第1区，再用1 μL接种环进行四区接种划线，并以同样方式接种于含万古霉素的巧克力平板和麦康凯平板上。使用一次性1 μL接种环沾取尿液样本，在血平板上以连续划线方式进行接种划线，以同样的方式接种于麦康凯平板。严格按照《全国临床检验操作规程》（第4版）[6]进行操作。

1.2.2 细菌培养 （1）Diascie ProBact。该系统为接种与孵育一体化装置，痰样本孵育环境为35 ℃ 5% CO2孵育箱，中段尿样本孵育环境为35 ℃普通孵育箱。（2）Copan Wasp。该系统连接有Copan WaspLab模块的孵育和镜像系统，承接通过轨道直接送入的接种好的平板。设置痰样本孵育环境为35 ℃ 5% CO2孵育箱，中段尿样本孵育环境为35 ℃普通孵育箱。（3）手工法。痰样本消化接种后置35 ℃ 5%CO2孵育箱内进行孵育培养，而中段尿样本置35 ℃普通孵育箱内孵育培养。

1.2.3 菌落鉴定 采用VITEK MS质谱鉴定系统对形成的菌落进行鉴定。

1.2.4 判读标准 培养24 h后，中段尿样本和痰样本分别按定量方式与半定量方式进行判读。痰样本判断标准为：一区＜10个菌落记为≤10×103cfu/mL；一区＞10个菌落且二区＜5个菌落记为100×103cfu/mL；一区＞10个菌落且二区＞5个菌落、三区＜5个菌落记为1 000×103cfu/mL；一区＞10个菌落且二区＞5个菌落、三区＞5个菌落记为≥10 000×103cfu/mL。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行统计分析。收集50例痰样本和50例中段尿样本的分离菌种、细菌生长量及有效单个菌落的数据，并保存平板上菌落分离效果图像。有效单个菌落以±s表示。采用多样本χ2检验对3种接种划线方法的不同菌落种属数量、不同细菌生长量进行比较，采用单因素方差分析对3种不同方法的有效单个菌落数量进行比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 分离菌种数量

2.1.1 痰样本 Diascie ProBact接种后分离出0（无细菌生长）、1、2及≥3种菌的样本分别为1、16、8和25例，Copan Wasp为1、14、10和25例，手工法为2、14、9和25例，3种方法之间比较，差异无统计学意义（P=0.987）。三者检出有意义致病菌分别为21、20和19例。

2.1.2 中段尿样本 Diascie ProBact接种后分离出0（无细菌生长）、1、2及≥3种菌的样本分别为20、16、8和6例，Copan Wasp分别为18、17、9和6例，手工法分别为19、18、7和6例，3种方法之间比较，差异无统计学意义（P=0.998）。

2.2 细菌生长量

50例痰样本及50例中段尿样本3种接种方法的细菌生长量结果见表1和表2。在痰样本和中段尿样本中，3种方法之间差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 有效单个菌落

50例痰样本及50例中段尿样本不同方法间有效单个菌落统计结果见表3。3种方法间痰样本和中段尿样本的有效单个菌落数量差异均无统计学意义（P＞0.05），三者中以Copan Wasp为最多。平板分离效果见图1和图2。Diascie ProBact与Copan Wasp菌落分区生长明显，单个菌落边界清晰，而手工法菌落生长略显密集，可能是手工用力不均所致。

3 讨论

目前，在检验其他专业都普及全自动流水线的情况下，大部分实验室的微生物检验仍采用传统的手工方法对临床微生物样本进行接种划线、培养、分离。然而手工方法因不同工作人员的手法、接种习惯和熟练程度不同，会对样本的分离效果产生直接而明显的影响，而且在样本接种时常发生“张冠李戴”的情况，同时在生物安全方面也存在着一定的隐患。全自动微生物分离培养流水线系统的研制成功及其在临床中的应用极大地改善了上述问题，可对样本的划线接种进行统一、规范的操作[7]，而且，由于全自动微生物流水线连接自动数字读板系统，附带条码识别功能，增强了样本的溯源性，避免了人为差错和手工的繁琐劳动，提高了样本的接种效率和菌落分离效果，可减少再次分离次数，为临床报告节省了时间，同时可实现微生物培养的实时监控，第一时间为临床提供早期实验室微生物检测信息[8-9]。

表1 50例痰样本不同方法的细菌生长量 （例）

表2 50例中段尿样本不同方法的细菌生长量 （例）

表3 痰样本和中段尿样本不同方法有效单个菌落数量（±s）

表3 痰样本和中段尿样本不同方法有效单个菌落数量（±s）

样本类型 Diascie ProBactCopan Wasp 手工法痰样本 9.78±5.37 10.48±5.59 8.82±5.31中段尿样本 8.78±4.38 9.74±4.49 7.33±5.03

图1 痰样本3种方法的分离效果

图2 中段尿样本3种方法的分离效果

本研究结果显示，在痰样本中，手工法无细菌生长2例，多于Diascie ProBact和Copan Wasp；检出细菌19例，低于Copan Wasp的20例和Diascie ProBact的21例，这可能是由于痰样本在前处理过程中Diascie ProBact及Copan Wasp均进行10～20 min的震荡消化，使其充分液化，均质性高，使得细菌得以完全释放，提高了培养阳性率，而手工接种法则是在常温下无震荡液化10 min，消化效果不及前二者，但总体比较，3种方法之间差异无统计学意义（P＞0.05），表明3种方法在痰样本分离菌落种属上性能基本一致，与文献报道[10]有所不同。而在中段尿样本中，Diascie ProBact无细菌生长20例，分别多于Copan Wasp的18例和手工法的19例，Diascie ProBact假性结果略高于后二者，其原因需进一步探讨。

在细菌生长量方面，Diascie ProBact在痰样本中分离出高浓度菌（≥10 000×103cfu/mL）33例，高于Copan Wasp的31例和手工法的27例。除了上述的可能原因之外，Diascie ProBact有接种与孵育一体化的装置，在接种划线完毕后无需转移平板，直接于孵育箱中按设置的条件进行孵育。Copan Wasp虽然自动化程度高，接种划线在仪器内完成，但平板仍需通过轨道运输进入孵育箱，而手工法划线后则需要人工将平板放入孵育箱，可能会对细菌培养产生一定的影响，尤其不利于苛氧菌的培养。然而，3种方法在痰样本和中段尿样本中的差异均无统计学意义（P＞0.05）。

本研究有效单个菌落生长情况及数量结果表明，手工法菌落生长相对集中且密集，分离度稍差。无论在痰样本还是中段尿样本中，Copan Wasp的有效单个菌落平均数量都最高，其次为Diascie ProBact，均优于手工法。提高有效单个菌落的分离数量，可以减少再次分离次数，以便尽早进入菌落鉴定及体外药物敏感性试验步骤，从而缩短报告时间[11-12]，尽快为临床提供准确的诊断数据。

尽管Diascie ProBact较手工法具有一定的优势，但仍然存在一些问题有待解决与完善：（1）痰样本采用四区的连续划线方式，从而导致从原区到第4区菌落数不是呈递减分布，这也是其单个菌落分离数量虽优于手工法，但不及Copan Wasp的原因所在；（2）接种环外周与平板的接触面积过大，导致接种样本悬液量较多，对细菌生长量有一定影响，故其计数均大于Copan Wasp和手工法；（3）培养基的垂直放置培养，可导致样本悬液沿平板流散，同样可导致菌量增多；（4）缺少条形码扫描系统，降低了样本的溯源性，易引起人工差错，增加出错率。

综上所述，国产Diascie ProBact体积小，占用空间小，费用经济，主要性能指标优于手工法，预处理装置可充分将痰液液化，匀质性好，提高了检测阳性率和效率，缩短报告时间，实现微生物接种划线的标准化、规范化，可替代手工法广泛应用于临床微生物实验室。