蜜蜂蜂毒皮下注射对家兔血小板聚集和粘附功能的影响

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1.云南省昆虫生物医药研发重点实验室/大理大学，云南 大理 671000；2.上海华汇拓医药科技有限公司，上海市 浦东新区 201203；3.药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心/大理大学，云南 大理 671000

脑血管疾病是全身性血管病变或系统性血管病在脑部的表现，是血管源性脑部病损的总称，中医称“中风”，具有发病率高、病死率高、致残率高和复发率高的特点，严重影响人们的健康以及社会经济的发展[1]。目前临床上常用的预防和治疗缺血性脑血管疾病的药物有溶栓、抗凝和抗血小板聚集药[2]，其中抗血小板治疗是缺血性脑卒中二级预防的重要手段[3]。因此，低毒副作用、可长期使用的抗血小板聚集药物的开发是当前防治脑血管疾病药物研发的热点之一。

动物毒素，如水蛭[4]、蚯蚓[5]、蛛毒[6]、蛇毒[7]，及昆虫毒素[8-9]等具有明显的抗血栓作用。蜜蜂蜂毒由蜜蜂的毒腺分泌并贮存于毒囊中，是一种成分复杂且药理作用较多的无色芳香液体[10]，研究发现，其具有很强的抗凝血[11]及抗血栓[12]作用，能使血液凝固时间明显延长。但是是否通过皮下注射蜜蜂蜂毒，研究蜜蜂蜂毒抗血小板聚集作用则未见相关报导。基于此，本课题以ADP二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate, ADP)、胶原(Collagen, COL)为诱导剂，研究蜜蜂蜂毒(BV)对家兔血小板聚集和粘附功能的影响，进一步探讨BV作为防治心脑血管病抗栓的可能性。

1 实验材料

1.1 动物 健康雄性家兔，体重2.0～2.5 kg，购于大理大学实验动物中心，适应性饲养3～5周后用于正式实验。实验条件：清洁级，室温16～22 ℃，相对湿度68%，12 h明暗交替照明，自由进食、饮水。

1.2 药物和试剂 蜜蜂蜂毒(BV，批号：20160927，药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心)；枸橼酸钠(批号：1204261，四川西陇化工有限公司)；氯化钠注射液(批号：C150120L，昆明南疆制药有限公司)；二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate，ADP，批号：7-16-5366，Helena工厂)；胶原(Collagen，COL，批号：5-16-5368，Helena工厂)；氯吡咯雷(批号：20140929，深圳市丽晶生化科技有限公司)。

1.3 仪器 AggRAM血小板聚集仪(Helena Laboratories)；BSA124S微量电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；TCL16M台式高速冷冻离心机(湖南湘立科学仪器有限公司)；DHG-9240电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；VORTEX-5漩涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；SK8200H超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。

2 方法

2.1 富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)的制备 参考文献的方法[13]，将血液加入含有3.2%枸橼酸钠的离心管中，使3.2%枸橼酸钠和血液的容积之比为1∶9。将上述得到的抗凝血充分混匀后25 ℃下以100 g的离心力离心10 min后取上层血浆即为PRP。然后将剩余的血浆，25℃下以2000 g的离心力离心15 min后取上层血浆即为PPP。

2.2 血小板聚集实验

2.2.1 实验分组 取健康雄性家兔30只，根据体重均分为5组，分别为生理盐水组(NS组)、氯吡格雷组(3.85 mg/kg·BW)、和BV 0.18、0.36、0.72 mg/kg·BW剂量组。其中，NS组为溶媒对照组、氯吡格雷组为阳性对照组[14]，氯吡格雷采用灌胃给药,灌胃体积是2.5 mL/kg,BV组采用皮下注射,体积为2 mL。

2.2.2 实验方法 各实验组连续给药5 d，每天上午给药1次，末次给药后1.5 h进行心脏取血，之后按照“2.1”的实验方法制备PRP和PPP。采用比浊法测定血小板聚集率：取PPP 250 μL于比浊杯中，以含PPP杯为基准调零，在PRP杯中分别加入25 μL的ADP、COL，诱导血小板聚集，测定5 min内血小板最大聚集率。其中，诱导剂ADP、COL的终浓度分别为6.07 μmol/L、3.03 μg/mL。抑制率的计算公式如下：

2.3 血小板粘附实验 动物分组、各组剂量和给药方法同“2.2.1”。各实验组 连续给药5 d，于末次给药后1.5 h时立即对家兔进行心脏取血，制备PRP和PPP，参考实验方法[15]加入35 μL的COL，在血小板聚集仪上进行温育搅拌10 min，分别测定加入COL前后血小板的光密度(Optical density，OD)值。血小板粘附率的计算公式如下：

其中常数1.11系加胶原后PRP被稀释的校正值。

2.4 统计学方法 使用SPSS 20.0进行数据处理，所有数据以均数加减标准差表示，采用One-Way ANOVA(即单因素方差分析)，事后检验采用LSD(最小显著性差异)法，方差不齐采用Tamhamne’s T2法。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 血小板聚集实验 BV低、中、高剂量连续注射5 d，开始家兔出现轻微呼吸加促的现象，第5天，家兔身体状况无明显变化，对家兔健康无不良影响。由表1可知，ADP诱导时，NS组的聚集率为(64.93±4.97)%。与NS组比较，氯吡格雷组、BV低、中、高剂量组均可以显著降低ADP诱导的血小板聚集率：59.31%(P<0.05)、26.54%(P<0.05)、36.62%(P<0.05)、51.11%(P<0.05)，受试药物各组呈量效依赖关系。由表2可知，COL诱导时，NS组聚集率(77.40±7.91)%。与NS组比较，氯吡格雷组和BV中、高剂量组的血小板聚集率都明显降低(P<0.05)其中BV高剂量组抑制率达62.90%，基本和阳性药相当。

组别剂量/mg/kg聚集率/%抑制率/%NS组- 64.93±4.97-氯吡格雷组3.8526.42±5.42**59.310.1847.70±3.18*26.54BV0.3643.10±13.21**36.620.7229.80±14.30**51.11

注：与NS 组比较，*P<0.05，**P<0.01。

组别剂量/mg/kg聚集率/%抑制率/%NS组-77.40±7.91 -氯吡格雷组3.8520.48±18.13**73.930.1862.60±13.0019.12BV0.3647.62±14.65**29.280.7228.72±13.34**62.90

注：与NS组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 血小板粘附实验 由表3可知，与NS组比较，氯吡格雷组、BV中、高剂量组均能降低COL诱导的血小板粘附性(P<0.05)，粘附抑制率分别为47.36%、43.94%、49.36%，BV中、高剂量组效果基本和阳性药相当。

组别剂量/mg/kg粘附率/%粘附抑制率/%NS组-79.25±7.53-氯吡格雷组3.8541.72±25.74*47.360.1868.95±4.7612.99BV0.3644.43±21.76*43.940.7240.13±28.01*49.36

注：与NS组比较，*P<0.05。

4 讨论

血小板的活化和聚集是血栓形成的重要病理基础。抗血小板药物是通过抑制血小板的异常形变、粘附、聚集和释放反应以抑制血栓形成和动脉粥样硬化等疾病的发展。因此抗血小板药物是防治心、脑血管疾病的重要药物。

血小板膜上有ADP、胶原、凝血酶等多种受体，任何一种受体被其诱导剂激活后，血小板表面即表达出纤维蛋白原受体(GPIIb-IIIa)，纤维蛋白原受体与纤维蛋白原结合，导致血小板聚集。不同的诱导剂使血小板活化聚集的能力也不同，如诱导能力强的凝血酶和COL可引发血小板内各种颗粒内容物的聚集；而诱导能力中等的花生四烯酸和血小板活化因子使血小板活化变形的能力不如上述的强诱导剂；诱导能力弱的5-HT和ADP则需要血小板分泌颗粒内容物协助其作用，方可引发血小板不可逆的聚集反应；诱导剂肾上腺素则只有在超过生理浓度下才能发挥作用[16]。ADP是引发血小板聚集的活性物质，虽然它本身是弱诱导剂，但其能增强或放大其它诱导剂的作用，比如一些弱的诱导剂如肾上腺素或5-HT等化学激活剂。氯吡格雷为ADP受体阻断剂，临床一线抗栓药物，本实验选其为阳性药。实验结果发现，蜜蜂蜂毒对ADP、COL诱导的家兔血小板聚集有较好的抑制作用。文献中[17]也有报道小剂量蜂毒可抑制ADP所引起的血小板聚集，这与本实验结果一致。

血小板粘附机制中有三种主要成分起作用：血小板膜糖蛋白、内皮下组份和vWF。血管内皮下基质的主要成分是纤维状I、III、VI型胶原、纤维连接蛋白和vWF等。当中最重要的是胶原，它既是经常发生血小板粘附的部位，激发血小板变形活化的能力也强。血小板的表面有两类主要的胶原受体：血小板GPVI和整合素α2β1(GPIa/IIa)，这两种受体可以直接粘附于胶原。但是GPIb/XI/V复合物粘附于胶原的过需要vWF介导[18]。参与血小板粘附过程的血小板膜糖蛋白主要有GPIIb-IIIa和GPIb-IX，二者分别在血小板粘附过程的不同阶段发挥作用，但都是vWF的受体。当GPIb-IX经vWF的桥连介导作用与胶原发生接触粘附时会致使血小板变形活化，同时GPIIb-IIIa的受体部位也会被暴露出来。GPIIb-IIIa之所以可以使血小板呈现伸展变形的粘附状态，是因为其可以粘附于vWF、纤维蛋白原以及多种的粘附蛋白(如：纤维连接蛋白)。

文献[19]多采用血小板粘附仪，利用血小板计数法计算粘附率，本研究参考文献[15]采用血小板聚集仪测定富血小板血浆OD值的方法计算粘附率。实验结果显示对胶原和血小板接触引起的粘附，阳性药氯吡格雷有显著地抑制作用，这与文献[20-21]报道一致。BV中剂量和高剂量组对血小板粘附也有一定的抑制作用，与阳性药比较差异无统计学意义。实验室前期的大鼠动静脉旁路实验中，BV可以抑制血小板在丝线上的粘附，与本实验结果一致。

综上所述，本研究表明蜜蜂蜂毒对ADP、COL诱导的家兔血小板聚集有一定的抑制作用，其还可以抑制血小板在胶原表面的粘附。本实验研究为进一步的抗脑缺血整体评价奠定基础，为预防和治疗心脑血管疾病提供一定的科学依据。