土壤熏蒸处理对连作三七生长发育及土壤理化性状的影响△

2018-07-31欧小宏刘迪秋王麟猛杨野崔秀明

中国现代中药 2018年7期

欧小宏，刘迪秋，王麟猛，杨野*，崔秀明*

(1.昆明理工大学，生命科学技术学院，云南昆明 650500；2.云南省三七资源可持续发展利用重点实验室，云南昆明 650500；3.国家中药管理局三七资源可持续发展利用研究室，云南昆明 650500；4.云南省文山七麒三七科技有限公司，云南文山 663000)

三七Panaxnotoginseng(Burk)F.H.Chen为五加科人参属植物，具有活血化瘀、消肿定痛等功效，是我国特有的名贵中药材。云南是三七的道地主产区，占总种植面积的98%以上，仅2016年的农业产值就高达100亿元，已成为云南省重要的经济支柱之一。三七是宿根植物，忌地性极强，三年七收获后的土地如再次种植(重茬)三七，发病率可达90%以上[1]。三七需要间隔(轮作或休闲)8～10年以上才能再次种植[2]。为此，三七种植不得不向非道地产区的贵州、四川等地扩散[3]，严重影响了三七的道地性。

当前，广大学者对三七连作障碍产生机制已有比较全面的认识，其产生原因主要有：(1)土壤微生物群落的改变，病原微生物增加，有益微生物减少，土传病虫害加剧；(2)化感物质引起的自毒作用；(3)土壤盐渍化和酸渍化加重及土壤养分等理化性状改变。根据其产生原因，对连作土壤进行灭菌是防治三七连作障碍的方式之一。如可采用有机硫熏蒸剂[4]、火烧[5]、臭氧熏蒸[6]等方式对连作土壤进行灭菌。清除三七连作土壤化感物质也是防治三七连作障碍的方式之一。如利用小麦与三七轮作可以消除连作土壤中的酚酸类物质[7]。此外，改善土壤理化性状也是防治三七连作障碍的方式之一。如通过合理的氮磷肥施用量[8]，以及添加土壤改良剂[9]、过氧化钙[10]等方式也可缓解三七种植土壤的连做障碍。

目前，土壤熏蒸消毒是防治蔬菜等作物连作障碍最有效的手段[11]。溴甲烷是应用最广且效果最优良的防治连作障碍的土壤熏蒸剂，能有效的防除土壤中的病原真菌、细菌、线虫、地下害虫及杂草等[12-13]。然而，由于溴甲烷对大气臭氧层的破坏性，从1997年开始逐渐被禁止使用，我国已于2015年全面禁止溴甲烷的使用[14]。当前已出现了各种溴甲烷的替代品，氯化苦就是较好的替代品之一。研究表明，氯化苦熏蒸处理能够杀死土壤85%以上的细菌、真菌和放线菌[15]，还对杂草具有一定的防治效果[16]。2015年农业部14号公告规定[17]：禁止杀扑磷、甲拌磷、甲基异柳磷、克百威、氯化苦、溴甲烷使用于蔬菜、瓜果、茶叶、甘蔗、中草药材等作物，将溴甲烷、氯化苦农药登记的使用范围变更为土壤熏蒸。虽然氯化苦不能直接用于作物杀菌，但用于土壤熏蒸是安全可靠的，氯化苦在土壤中的半衰期只有0.2～4.5 d[18]，连续使用对土壤及农作物无残留，也无不良的影响，对地下水无污染[19]。我国山东地区已广泛采用氯化苦熏蒸土壤防治姜瘟[20]。因此，利用氯化苦熏蒸土壤防治连作障碍具有十分广阔的应用前景，但其在三七连作障碍防治中的应用鲜见报道。

因此，本研究采用田间小区试验研究了氯化苦熏蒸处理三七连作土壤，探索了该处理对连作土壤理化性质、三七生长及品质、氯化苦残留量等的影响，以期为氯化苦在三七连作障碍防治中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验于2015—2016年在云南省文山州文山市平坝镇进行，E：104°8′6.918″，N：23°15′18.458″。试验区属中亚热带季风气候，海拔1756 m，年均日照时数2028 h，年均积温6 829.3℃，年平均气温18.4℃，年均昼夜温差11.7℃，平均相对湿度75%，年均降雨量1 187.8 mm，无霜期323～329 d。供试土壤为红壤，是种植2年(一轮)三七的连作土壤，中间无间隔或轮作，基本理化性状为：pH 6.50，有机质8.42 g·kg-1，全氮 0.81 g·kg-1，碱解氮 88.72 mg·kg-1，全磷 0.94 g·kg-1，有效磷 60.47 mg·kg-1，全钾 11.22 g·kg-1，速效钾 170.57 mg·kg-1。

1.2 供试材料

一年生三七幼苗购于文山三七市场，复合肥(N-P2O5-K2O=15∶15∶15，云南云天化国际化工股份有限公司)，氯化苦(CCl3NO2，大连绿峰化学股份有限公司)。

1.3 试验设计

试验采用田间小区实验，小区规格为2 m×15 m，设无熏蒸和熏蒸两个处理，重复3次。无熏蒸处理为对照，即土壤不做任何处理；熏蒸处理为先用氯化苦熏蒸处理土壤，具体操作：将地深翻平整后，氯化苦用量为50 g·m-2，利用专用注射器注射到土壤墒面15 cm土层后，立即覆盖薄膜对土壤进行熏蒸消毒处理，20 d后揭去薄膜，再自然晾晒15 d，备用。所有三七种植农事操作均按照常规管理进行。2015年1月10日按照株行距15 cm×20 cm移栽一年生三七，分别于2015年和2016年3月和7月追施复合肥2次，追肥量分别为每亩100和120 kg(1亩≈666.7 m2)。三七出苗整齐后，对各处理每月存苗率进行调查统计，于2015年7月(二年生)和2016年12月(三年生)对三七和土壤进行取样，测定三七农艺性状、土壤理化性状、氯化苦残留量及药效成分成分含量。

1.4 测定项目

1.4.1 存苗率及农艺性状三七出苗整齐后对各处理存苗数进行调查统计，由于无熏蒸处理三七于2015年8月左右已无存苗，故未对其2016年三七存苗率和农艺性状进行统计。

(1)

2015年7月(二年生)和2016年12月(三年生)取样测定三七株高、叶片长宽、剪口长宽、块根长宽、须根长、生物量等农艺性状后，自然风干，粉碎，备用。

1.4.2 土壤理化性状 2015年7月和2016年12月分别取无熏蒸和熏蒸处理土壤样品，并测定其理化性状。参考《土壤分析技术规范(第二版)》[21]，pH采用电位法，交换性酸采用KCl交换-中和滴定法，石灰需要量采用氯化钙-中和滴定法，阳离子交换量采用乙酸铵交换法，有机质采用重铬酸钾-容量法，全氮采用凯氏定氮法，碱解氮采用碱解扩散法，全磷采用氢氧化钠熔融-钼锑抗比色法，有效磷采用Olsen法，全钾采用氢氧化钠熔融-火焰光度法，速效钾采用乙酸铵浸提-火焰光度法。

1.4.3 土壤微生物数量 2015年7月和2016年12月分别取无熏蒸和熏蒸处理土壤样品，保存于4 ℃冰箱，用于细菌、真菌和放线菌数量测定。参考刘星等[22]采用稀释平板法，真菌采用马丁培养基，细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，放线菌采用高氏1号培养基。

1.4.4 氯化苦含量测定

样品提取：10 g土壤或植株样品于具塞三角瓶加50 mL石油醚，冰箱中浸泡过夜，超声提取10 min，静置1小时，取上清液用气相色谱测定。

仪器：Agilent 7890A气相色谱仪配备Agilent 7694E顶空自动进样器和电子捕获检测器，安捷伦公司毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

色谱条件：进样口温度150 ℃，柱温60 ℃，保持6 min，检测器温度250 ℃，载气为高纯氮气，载气流量20 mL·min-1，分流比30∶1，柱流量1 mL·min-1，尾吹30 mL·min-1。顶空进样器条件：炉箱温度80 ℃，样品环温度85 ℃，传输线温度90 ℃，瓶加热时间3 min，瓶加压时间0.1 min，样品环填充时间0.5 min，样品环压力稳定时间0.05 min，进样时间0.5 min，循环时间6 min[19]。

1.4.5 三七素和皂苷含量测定

三七素提取：取0.5 g三七粉末样品，加入10 mL超纯水，超声提取15 min，3000 r·min-1离心，重复提取2次，合并上清液，定容至25 mL，供HPLC用。

HPLC条件：X-Amide色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为0.2%磷酸(A)-乙腈(B)，洗脱条件：0 min 70% B，10 min 76% B，15 min 80% B，流速为1.0 mL·min-1，检测波长213 nm，柱温24oC，进样量10 μL[23]。

三七皂苷含量测定皂苷提取：取0.3 g三七样品，加25 mL 70% 甲醇浸提过夜，超声40 min，3000 r·min-1离心10 min，取上清液过0.45 μm滤膜，备用。

HPLC条件：色谱柱为Thermo Scientific Hypersil GOLD C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为水(A)-乙腈(B)进行线性洗脱(V/V)，洗脱条件为0 min 20% B，20 min 40% B，40 min 50% B，50 min 100% B；流速为1 mL·min-1；柱温为 30 ℃；检测波长为203 nm[24]。

1.4.6 数据分析采用SPSS 18.0对实验数据进行独立样本T检验。

2 结果与分析

2.1 氯化苦熏蒸处理对连作三七存苗率及农艺性状的影响

无熏蒸处理的出苗率，即2015年3月存苗率(65%)比熏蒸处理(88%)低21%；无论熏蒸与否，三七存苗率均显著降低，但无熏蒸处理出苗5个月后(8月)已全部死亡，熏蒸处理三七存苗率移栽一年后为68%，移栽2年后仍有60%，在移栽第二年内基本无死亡。说明氯化苦熏蒸处理连作土壤能够降低三七死亡率，提高出苗率和存苗率。

注：由于无熏蒸处理于2015年8月存苗率已为0，故无熏蒸处理没有统计2016年存苗率。图1 氯化苦熏蒸处理对连作三七存苗率的影响±SD，n=3)

无熏蒸处理三七根系发育差，须根少且短，而熏蒸处理根系发育良好，须根多且长(图2)。表1也表明，熏蒸处理三七的株高，叶片长、叶柄长、须根长、剪口长和宽，主根长和宽，主根生物量等指标均显著或极显著大于未熏蒸处理，其中主根鲜重增加了84%，主根干重增加了111%。说明氯化苦熏蒸处理可以促进连作三七生长，尤其是根系生长。

注：图中三七为二年生，取于2015年7月。图2 氯化苦熏蒸处理对连作三七生长状况的影响

表1 氯化苦熏蒸处理对连作三七农艺性状的影响

注：无熏蒸处理于2015年8月存苗率已为0，故2016年无熏蒸处理无三七样品;*和**表示无熏蒸和熏蒸处理2015年三七农艺性状分别在P<0.05和0.01水平差异具统计学意义。

2.2 氯化苦熏蒸对连作三七土壤理化性状变化的影响

与无熏蒸处理相比，熏蒸处理连作三七土壤1年后(2015年)，土壤pH、阳离子交换量、全磷和全钾含量均无显著变化；交换性酸、石灰需要量、全氮、碱解氮、有效磷含量显著降低，降幅分别为56%、15%、15%、17%和47%；而有机质和速效钾含量显著增加，增幅分别为16%和65%(表2)。与无熏蒸处理相比，熏蒸处理连作三七土壤2年后(2016年)，土壤pH、石灰需要量、全氮、碱解氮和全钾含量均无显著变化；交换性酸、全磷和有效磷含量显著降低，降幅分别为39%、31%和52%；而阳离子交换量、有机质和速效钾含量均显著增加，增幅分别为13%、15%和56%(表2)。说明氯化苦熏蒸连作三七土壤可降低其交换性酸、石灰需要量，增加土壤有机质和速效钾含量，但会降低土壤氮、磷含量。

表2 氯化苦熏蒸对连作三七土壤理化性质的影响

注：***，**和*分别表示无熏蒸和熏蒸处理间在P<0.001，P<0.01和P<0.05水平差异具有统计学意义。

2.3 氯化苦熏蒸对连作三七土壤微生物数量变化的影响

与无熏蒸处理相比，氯化苦熏蒸处理使土壤细菌、真菌和放线菌数量均显著降低，其中细菌数量2015年和2016年分别降低了50%和37%；真菌数量2015年和2016年分别降低了19%和28%；放线菌数量2015年和2016年分别降低了38%和38%(图3)。说明氯化苦熏蒸可以使连作三七土壤细菌、真菌和放线菌数量减少。

注：***，**和*分别表示无熏蒸和熏蒸处理间在P<0.001，P<0.01和P<0.05水平上达到显著差异。图3 氯化苦熏蒸处理对连作三七土壤微生物数量的影响

2.4 氯化苦熏蒸处理对氯化苦残留的影响

无论熏蒸与否，在土壤和植株中均未检测到氯化苦(表3，图4)，说明氯化苦熏蒸连作三七土壤不会造成氯化苦在土壤和植株中的残留。

表3 氯化苦熏蒸处理对连作三七土壤及植株氯化苦残留量的影响

注：N.D.表示未检出。

2.5 氯化苦熏蒸处理对连作三七地下部分有效药用成分含量的影响

表4表明，与无熏蒸处理相比，氯化苦熏蒸处理对连作三七地下部分三七素、三七皂苷R1和人参皂苷Rb1含量均无显著影响，但显著降低了人参皂苷Re含量，显著增加了人参皂苷Rd含量，但对这5种皂苷的总和无显著影响。说明氯化苦熏蒸连作三七土壤不会影响三七有效药用成分含量。

注：a.氯化苦标准品；b.土壤样品；c.三七植株样品。图4 氯化苦气相色谱图

表4 氯化苦熏蒸对连作三七药用成分含量的影响

注：由于无熏蒸处理于2016年已无存活，故二年生三七取于2015年7月，熏蒸处理三年生样品取于2016年12月；*表示无熏蒸和熏蒸处理之间二年生三七药用成分含量在P<0.05水平差异具统计学意义。

3 讨论

3.1 氯化苦熏蒸对连作三七存苗率及土壤理化性状影响

连作三七发病率在90%以上[1]，主要是因为种植三七会使土壤微生物组成发生变化[2，25-26]、土壤养分失衡[27-28]等。张子龙等研究发现连作三七土轮作7年后三七存苗率可以达到60%，土壤中细菌数量降低，放线菌数量增加[2]。欧小宏等也发现通过“调酸，减氮，保磷，增钾，补充微量元素”的施肥方式，以及添加甘蔗渣作为土壤改良剂，可以提高连作三七的存苗率达31.6%[9]。本研究表明，氯化苦熏蒸处理连作三七土壤后，三七移栽一年后的存苗率达到68%，移栽2年后存苗率达到60%(图1)。该结果与连作三七土轮作7年后的存苗率(60%)相似[2]，说明氯化苦熏蒸连作三七土壤可以缩短连作三七土壤的轮作时间。一方面是因为氯化苦对土壤微生物的杀灭率在85%以上[15]，在短期内微生物会呈现“抑制-恢复”的趋势[29]，从而使有益与有害微生物的数量趋于平衡。本研究结果表明，氯化苦熏蒸处理使连作三七土壤细菌、真菌和放线菌数量显著降低(图3)，与寻路路[30]发现三七健康株根际土细菌数量显著低于病株根际土，而真菌数量显著高于病株根际土的结果相似。另一方面是因为氯化苦熏蒸能够杀死土壤中微生物，打破了土壤矿质元素的矿化与微生物固持之间的平衡，使其矿化作用大于固持作用，从而可以提高土壤中矿质元素含量[31-32]，有利于连作三七土壤养分平衡。本研究结果发现氯化苦熏蒸处理使连作三七土壤中氮、磷含量显著降低(表2)，该结果与张子龙等[2]研究发现连作三七土壤轮作7年后土壤氮、磷含量降低相似，但与马涛涛等[31]和颜冬冬等[32]发现氯化苦熏蒸使土壤氮含量升高相反。主要原因可能是熏蒸处理连作土壤后再种植三七，土壤中的氮磷钾被三七植株吸收带走；不熏蒸处理直接种植，三七在移栽后8个月内全部死亡，土壤中氮磷养分大部分仍保留在土壤中，从而增加了养分的微生物固持量。此外，本研究还表明氯化苦熏蒸处理降低了连作三七土壤交换性酸、石灰需要量(表2)，这也是导致连作三七存苗率较高的原因。因为三七种植使土壤酸化是导致连作障碍的原因之一，通过添加石灰调节土壤酸性可以使三七的存苗率增加[9]。

3.2 氯化苦熏蒸对连作三七产量及品质影响

3.3 土壤及三七药材氯化苦残留

本研究表明氯化苦熏蒸处理连作三七土壤，不会导致氯化苦在三七植株中残留(表3，图4)，结果与氯化苦熏蒸土壤后种植黄瓜和番茄，其果实中也不会有氯化苦残留的结果一致[36]；也不会导致氯化苦在土壤中残留(表3，图4)，因为氯化苦的半衰期仅0.2～4.5 d，11天后在土壤中基本检测不到氯化苦残留[37]。虽然氯化苦对土壤进行熏蒸消毒具有操作简单、不会对土壤和作物造成残留等优点，但也需要注意氯化苦具有极高的蒸汽压，对人体眼睛、黏膜、肺以及皮肤具有强烈的刺激性[38]。所以为防止因氯化苦散发而降低熏蒸效果，以及对人体的危害，利用氯化苦对连作三七土壤进行熏蒸消毒时，应将氯化苦施入土层并立即覆盖薄膜防止其挥发；操作人员要严格按照操作规范进行土壤消毒作业。此外，加强机械作业、研发新剂型等也将是氯化苦在三七连作障碍防治中需要加强的研究方向。综上，氯化苦在三七连作障碍防治方面具有广阔的应用前景。