不同活度不同剂量125I粒子植入对兔肝脏纤维化的影响

孙 柏， 潘天帆， 陆 建， 王 超， 王 勇， 常晓峰， 郭金和

肝癌是临床常见的恶性肿瘤，全球范围内肝癌发病率排第5位，致死率排第2位，占世界癌症死亡患者的9.1%［1-2］。放射治疗是肝癌治疗的主要方式之一。外放疗研究发现，随着放射剂量的增加，肝脏放射性损伤尤其是肝脏纤维化的发生率及致死率也逐渐增加［3］。近年来，放射性125I粒子近距离治疗因其微创、高精度、低剂量率、持续照射、可重复植入等优点，在临床应用中取得了良好的效果。目前，125I粒子肝脏植入安全性的相关研究中，尚未见关于125I粒子植入后对肝脏放射性损伤肝脏纤维化的相关研究，为此，本实验拟通过兔肝脏植入不同活度的125I粒子，判断术前及术后6个月兔实验指标及肝脏病理学结果，进行对比分析，来研究不同剂量、不同活度的125I粒子植入对肝脏纤维化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康家兔16只，雌雄不拘，体重在2.5～4.0（3.2±0.6）kg。所有家兔在自由进食和饮水的标准动物饲养室分隔喂养。

1.1.2 仪器与设备 不同活度的125I粒子（上海欣科医药有限公司）64粒；表面放射活度及粒数分别为：空仓粒子×16粒，2.22、2.96和 3.70 MBq各 16粒。籽源出厂前经捡漏试验、沾活检验、活度测量，合格者按A型包装送动物手术实验室。影像监视设备：Sensation 64 层螺旋 CT（Siemens）。

1.2 方法

1.2.1 动物的分组 16只实验兔采用随机数字表随机分为4组，每组4只，按照植入的粒子活度分别编号为A、B、C、D组，其中A组为空仓组，B组粒子活度为2.22 MBq，C组为2.96 MBq，D组为3.70 MBq。

1.2.2 操作过程及术后处理

1.2.2.1 术前每只实验兔经静脉取血，行血细胞、肝功能、肝纤维化4项。

1.2.2.2 术前6 h禁食禁水，手术开始前于耳缘静脉按1 mL/kg的剂量缓慢注射3%戊巴比妥那注射液，静注速度为2 mL/min，注射药物量达到总量的90%时判断实验兔神经反射情况，按需给予剩余药物或加量。

1.2.2.3 粒子植入前计算并取出所需数量的粒子，于2%戊二醛溶液中浸泡20 min，经无菌0.9%NaCl溶液冲洗后，置入粒子释放装置中。植入时将释放装置对准穿刺针的操作孔，按顺序激发扳机即可。

1.2.2.4 麻醉满意的实验兔取左侧卧位，固定于操作台，行腹部CT平扫，确定CT横断位扫描下肝脏扫描的最大层面为穿刺层面，确定穿刺点、穿刺路径、深度（图1①）。标准消毒，无菌操作，取碘粒子植入针2支，沿预定穿刺点及穿刺路径以间隔1 cm平行排列的方式穿刺至预定深度（图1②），拔出穿刺针针芯，取装配好的粒子释放装置，通过针芯每穿刺针送入1颗粒子，后撤1 cm，再次推送1颗粒子；采用粒径1 000 μm的明胶海绵栓塞针道；CT扫描观察粒子排布情况及穿刺路径出血情况。术后12 h恢复正常饮食。粒子植入过程见图1。

1.2.2.5 术后利用计算机治疗计划系统（TPS）分别勾画B、C、D组家兔中植入粒子的120 Gy、140 Gy、160 Gy等剂量曲线图，并计算与中心点距离。按照B、C、D组相应放射剂量的平均距离计算A组的距离粒子中心点的距离。

1.2.3 实验兔的观察及处死 ①术后评价实验兔一般状况，包括进食量、活动状况；②术后6个月每只实验兔再次经静脉取血，复查血细胞、肝功能、肝纤维化4项、凝血功能等指标；③术后6个月处死所有实验兔，剖腹取出肝脏组织，DSA下确定粒子位置，分别按照计算距离选取每组实验兔120 Gy、140 Gy、160 Gy辐射剂量区周边的肝脏组织，4%甲醛浸泡、固定，行HE及天狼猩红染色，行Knodell HAI评分。

1.2.4 评价指标 术后兔进食及活动情况；兔血实验室检查结果：肝功能、血常规、肝纤维化4项、APRI指数；病理学结果：HE染色、天狼猩红染色、Knodell HAI评分。其中：Knodell HAI评分标准为：0分：无纤维化；1分：汇管区扩大；2分：多数汇管区纤维化±短纤维间隔；3分：桥接区纤维化、汇管-汇管区纤维化或汇管中央桥接区纤维化；4分：肝硬化。

图1 粒子植入过程

1.3 统计方法

所有数据采用SPSS 22.0统计分析软件进行处理，计量资料以（±s）表示，各组连续资料测值之间的差异采用单因素方差分析；统计结果以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

所有手术均顺利完成，术中无实验兔意外死亡。术后1周内，家兔活动减少，进食减少，2周左右基本恢复正常。

2.1 各组实验兔血肝纤维化4项测定结果

A组术前与术后各项肝纤维化四项指标组之间差异无统计学意义（HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C间P值分别为：0.17、0.155、0.254、0.282）。 B、C、D 组之间，随着粒子活度的增加，各项指标测定结果有升高的趋势，且3组彼此之间以及与A组结果间均存在统计学差异（P＜0.05），但是各组指标基本处于正常范围内。见表2。

2.2 各组实验兔谷草转氨酶、血小板、APRI指数结果

分析ALT、AST结果发现，C组与D组结果较其余3组明显有升高，且超出正常高值，但C、D两组之间差别无统计学意义（PALT＝0.196、PAST＝0.154）；APRI比较显示：A组术前、A组术后、B组3组之间差异均无统计学意义，C组与D组之间差异均无统计学意义，但是术前组、A组、B组3组均与C组、D组之间差异有统计学意义，且后两组较前3组APRI值有明显升高，但是所有组的APRI＜0.50。见表3。

表1 Knodell HAI肝纤维化评分标准

表2 各组家兔肝脏纤维化4项测定结果±s

表2 各组家兔肝脏纤维化4项测定结果±s

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表3 各组家兔各组家兔谷ALT、AST、PLT、APRI指数结果 ±s

表3 各组家兔各组家兔谷ALT、AST、PLT、APRI指数结果 ±s

注： APRI=[AST（U/L）/AST 正常值上限（U/L）/PLT（×10^9/L）]×100

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2.4 组织病理学观察

在所有病理标本中，A组所有肝组织肝索、肝窦结构存在，肝细胞轮廓清晰，结构完整，未见明显肝细胞形态学改变，肝脏纤维化评分均为0分；B组中，放射剂量为160 Gy的病理标本中有1只兔病理结果内可见较多量细胞凋亡，评分为1分，其余所有B组肝脏观察结果与A组相仿，评分为0分。C组与D组的病理标本中，仅D组中照射剂量为160 Gy的病理中有1只兔未见明显肝细胞损伤，评分为0分，其余绝大部分肝脏标本的HE染色中，可见肝窦管壁变厚内皮化、肝细胞脂肪变性、炎细胞浸润、肝细胞融合，评分为1分。其中，D组较C组程度稍有加重。在天狼猩红染色片中，D组中照射剂量为160 Gy的病理标本中可见轻度肝窦管壁红染，纤维组织增生外（图2），余病理标本均未见明显异常。与HE染色结果基本吻合。

图2 肝脏标本组织学比较

分析结果显示同一组内，不同照射剂量的病理结果Knodell HAI评分相近，但是随着粒子活度的不断增加，即使辐射剂量较低时，也可发现Knodell HAI评分有升高的趋势，但是评分不达到肝脏纤维化级别。

3 讨论

125I粒子植入在临床恶性肿瘤治疗中的应用越来越广泛［4-5］。125I粒子源能够持续释放27.4～31.4 KeV的X射线和35.5 KeV的γ射线，人体组织穿透距离短，放射性粒子植入具有高度适形性、靶区与正常组织分配比高等优点［6］。目前，125I粒子植入在治疗肝脏恶性肿瘤方面取得了良好的效果。郑家平等［7］报道40例难治性肝癌患者接受125I粒子植入治疗，疗效分析显示近期客观有效率37.5%，疾病控制率达到75%，中位肿瘤进展时间和中位总生存时间分别为7个月和10个月。刘健等［8］报道125I粒子植入治疗32例肝门区肝癌，结果显示患者中位生存时间为10个月，总有效率为68.8%。但在上述相关文献报道中，TPS中的碘粒子植入的处方剂量在120～160 Gy，且粒子活度的选择没有明确的参考［7-8］。大量研究发现，肝脏肿瘤是放疗中度敏感器官［9］，放射性肝损伤是肝癌放疗过程中最严重的剂量依赖性并发症，放疗患者中约有75%患者会出现肝功能不全及肝脏纤维化［10，11］，严重影响患者的生存质量及预后［12］。 张冰等［13］研究发现125I粒子植入术后第1、2个月肝功能检查显示转氨酶水平较术前明显升高，且存在统计学差异（P＜0.05）；而王福安等［14］的相关动物研究证实：当肝脏植入的125I粒子活度＜0.7 mCi时相对安全，但是该实验并未涉及剂量方面的研究，且实验时间跨度相对较短。因此，探究不同剂量、不同活度125I粒子植入是否会导致肝脏慢性损伤，尤其是肝脏纤维化，具有一定的实际意义。

本研究采用临床常用活度的125I粒子进行动物实验，探讨不同活度、不同剂量粒子植入术后肝功能、血常规、肝纤维化4项等指数的变化情况及粒子源旁不同剂量区域肝脏形态学变化，来研究不同活度125I粒子植入对肝脏纤维化的影响。实验室检查结果提示：125I粒子植入术后6个月，随着粒子活度的增高，高活度组兔ALT、AST均较低活度组及对照组有轻度升高，且其间存在统计学差异，说明随着粒子活度达到一定程度后，会导致肝脏的慢性损伤；LN、PCⅢ、Ⅳ-C、HA、APRI指数均没有达到肝脏纤维化的程度，但是随着粒子活度的增加，各项指标值有明显升高的趋势，且低活度组与高活度组之间差异存在统计学意义，这提示随着粒子活度的增加，肝脏纤维化的风险是存在的，这与对应组的病理结果相一致。上述结果提示：125I粒子植入治疗肝脏恶性肿瘤时，粒子活度的选择需要慎重考虑。且当植入的粒子活度较高时，术后可以适当使用保肝药物。

本研究病理结果显示，在肝脏内植入的粒子照射剂量小于160 Gy、粒子活度小于3.7 MBq时，所产生的内照射均不会导致肝脏纤维化。但在不同活度的分析中我们发现，高活度组的病理切片染色中肝窦管壁内皮化、肝细胞脂肪变性、炎细胞浸润、细胞融合等病理学改变较低活度组明显增多；且随着粒子活度的增加，肝脏纤维化评分有明显升高的趋势。说明较大活度的碘粒子植入后释放的γ射线会引起周围肝组织的损伤，但该损伤尚不至于导致肝脏纤维化。研究显示，凋亡可能是低剂量率辐射起到杀伤作用的主要机制［15］。另有体外研究发现，125I粒子照射可改变细胞周期分布，使细胞周期阻滞于G2/M期，抑制细胞分裂、增生，甚至导致其死亡，且随着粒子活度增加，效果有逐渐增强的趋势［16-17］。这与本研究结果基本吻合。

Park等［18］早期研究发现，在外放疗总照射剂量小于 40 Gy、40～50 Gy、大于 50 Gy的患者中，肝脏毒性的发生率分别为4.2%、5.9%和8.4%；而在本实验的每组对照组中，在相同粒子活度下，粒子的不同剂量组病理标本评分之间未见统计学差异。这至少提示我们，125I粒子植入患者，在不考虑粒子活度的前提下，TPS中的处方剂量在≤160 Gy时，均可认为是安全的。这与目前临床治疗肝癌患者常使用的处方剂量是相吻合的［19］。考虑可能与粒子植入后放射线是缓慢持续释放存在一定关系，也可能与机体自身适应和抵抗存在一定关系，但具体原因尚需要深入研究。同时，更大内照射剂量是否会导致肝脏慢性损伤、肝脏纤维化，有待进一步研究验证。

此外，本研究中的肝脏纤维化4项、APRI指数等反映肝脏纤维化的实验室检查结果与肝脏病理结果相吻合，在某种程度上提示我们，肝脏纤维化4项、APRI指数评价肝纤维化程度是相对可靠的，在临床工作中尤其是当遇到难以取得病理结果的情况下，对于是否给予患者加强保肝及抗纤维化治疗，上述实验室指标具有一定的参考意义。

然而，本实验还存在一定的缺陷。首先，粒子放射是缓慢衰减的，虽然选取的肝脏不同剂量点组织尽可能接近所需目标值，但是与真正的放射剂量点之间仍存在一定的误差。其次，肝脏粒子植入在临床上常用于治疗肝脏恶性肿瘤，本实验因考虑到肝癌模型兔的生存时间，未予建模。最后，本实验为尽可能分析剂量、活度等因素对肝脏纤维化的影响，分组较多，虽然样本量符合统计学要求，但是样本相对较少，这些将在后续实验中进一步完善。

总之，在目前临床常用处方剂量下的肝脏125I粒子植入是安全的，并不会导致肝脏纤维化；但是，在粒子活度的选择方面，仍需要慎重考虑。更大区间的不同活度、不同剂量的125I粒子对肝脏纤维化的影响，有待进一步的研究结果来验证。