北沙参抑制肺癌细胞迁移侵袭能力的研究※

● 王振飞 刘 丽 梁 琳 张 晋 李佳晨 郝 钦▲

肺癌是严重威胁人类健康与生命的一种疾病，其发病率与死亡率均居各种恶性肿瘤之首[1]。造成肺癌患者高死亡率的主要原因在于其高侵袭转移率。手术和放疗无法清除、杀灭转移的肿瘤细胞，已有的化疗药物大都毒副作用巨大，极大降低了患者的生活质量和治疗效果[2]，而且一些化疗药物还会加速肿瘤细胞的进化，促进肿瘤的浸润和转移[3]。急需以新的思路研发无毒、高效的抑制肺癌细胞侵袭转移的药物。

中国医药学博大精深，尤其在肿瘤治疗方面，更有其独特之处。它不是仅着眼于杀灭肿瘤细胞，而是提出了“扶正固本”“清热解毒”“软坚散结”等一系列治疗思路。许多低毒、无毒中药在肿瘤治疗中都发挥了显著的功效[4]。北沙参是一味常用无毒中药，入肺、胃经，善治肺脏疾患，具有养阴清肺、生津润燥、祛痰止咳等作用，在许多抗肺癌方剂中都有广泛应用[5]。我课题组在研究中发现，北沙参可以有效抑制肺癌细胞的迁移和侵袭能力，并探讨了它的作用机理。

1 材料

1.1细胞株人正常支气管上皮细胞系16HBE购自南京凯基生物技术有限公司，人肺癌细胞系H460购自中科院上海生命科学院细胞库。

1.2药物北沙参生药饮片购自内蒙古中医院药房。将生药磨为细粉，过200目筛，75%乙醇回流提取2次，每次40min，过滤，合并滤液，回收乙醇，浓缩至稠膏，冷冻干燥，得到干粉。干粉用PBS(磷酸盐缓冲液)溶解，配制成浓度为100mg/mL(按生药计算)的提取液。

1.3试剂胎牛血清、RPMI-1640培养液、PBS、胰蛋白酶消化液均购自Gibco公司，CCK-8试剂盒(C16038)购自上海碧云天生物技术有限公司，Marigel基质胶购自BD Biosciences，总RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自Takara公司，荧光定量PCR试剂盒购自上海翊圣生物，ELISA试剂盒购自北京百智生物技术公司。

1.4仪器二氧化碳恒温培养箱(Thermo)，超净工作台(苏州金燕)，倒置相差显微镜(Nikon TE2000)，多功能酶标仪SpectraMax® i3x(Molecular Devices)，7500 Real-Time PCR Systems(Applied Biosystem)。

2 方法

2.1细胞培养16HBE和H460细胞培养于含10%胎牛血清、0.1%双抗的RPMI-1640培养基(完全RPMI-1640培养基)中，37°C、5%CO2、饱和湿度培养箱中常规培养，取对数生长期细胞进行实验。

2.2 CCK-8法检测细胞毒效应将16HBE细胞悬于完全RPMI-1640培养基中，调整浓度为2.5×104个/mL，接种于96孔板(0.2mL/孔)。培养12h后，药物组加入北沙参提取液(终浓度为1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL)，对照组加入等体积的PBS。继续培养24h后，每孔加入CCK-8溶液20μl，培养箱内孵育1h。以450nm为检测波长、以650nm为参考波长，测定吸光度。

2.3 Transwell法检测细胞迁移能力将H460细胞以106个/mL悬于无血清RPMI1640培养液。向Transwell小室的每个上室中加入150μl细胞悬液，同时加入北沙参提取液，使其终浓度为5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL；向每个下室中加入650μl含20%胎牛血清的RPMI 1640培养液。培养24h后，取出上室，吸弃液体，PBS漂洗，棉签轻轻擦掉膜上面的细胞，滤膜用甲醇固定30min，苏木素染色15min，显微镜下，选取膜的上、下、左、右、中5个不同区域计迁移细胞数。

2.4 Matrigel法检测细胞侵袭能力将H460细胞以106 个/mL悬于无血清RPMI 1640培养液。用预冷的无血清RPMI 1640培养液稀释Matrigel，取100μl稀释液加入Transwell小室的上室，小室置于37°C 4h，使胶凝固。向每个上室中加入150μl细胞悬液，同时加入北沙参提取液，使其终浓度为5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL；向每个下室中加入650μl含20%胎牛血清的RPMI 1640培养液。培养24h后，取出上室，吸弃液体，PBS漂洗，棉签轻轻擦掉膜上面的Matrigel及未穿过膜的细胞，滤膜用甲醇固定30min，苏木素染色15min，显微镜下，选取膜的上、下、左、右、中5个不同区域计侵袭细胞数。

2.5荧光定量PCR法检测TIMP2(组织型基质金属蛋白酶抑制剂2)表达水平H460细胞传代培养24h后，药物组加入北沙参提取液，使其终浓度为5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL，对照组加入等体积PBS。作用24h后，提取各组细胞的总RNA，经浓度和纯度检测后，反转录为cDNA，实时荧光定量PCR检测。PCR条件：95°C 30s，(95°C 5s，60°C 31s)×40个循环。所用引物：TIMP2上游引物 5’-TCTGGATGGACTGGGTCACA-3’，TIMP2下游引物5’-CTTGATGCAGGC GAAGAACTT-3’；GAPDH上游引物5’-TGTCCCCACTGCCAACGTGTCA-3’，GAPDH下游引物5’-GCGTCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3’。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算TIMP2的相对mRNA表达量。

2.6 ELISA检测培养液中TIMP2的含量取对数生长期的H460细胞，药物组加入北沙参提取液，使其终浓度为5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL，对照组加入等体积PBS。作用24h后，换为无血清培养基，培养24h后，收集培养上清，按试剂盒说明书操作，检测TIMP2浓度。

2.7统计学方法采用SPSS17.0统计软件对数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差表示，采用单因素方差分析进行检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1北沙参提取液对16HBE细胞增殖能力的影响CCK-8检测结果显示，在5mg/mL到15mg/mL浓度范围内，北沙参提取液对正常支气管上皮细胞16HBE的增殖能力无影响，说明其对正常支气管上皮细胞无毒性作用。见表1。

组别OD值对照组0.580±0.0065mg/mL组0.570±0.00810mg/mL组0.564±0.01515mg/mL组0.565±0.014

3.2北沙参提取液抑制H460细胞迁移能力的影响

Transwell迁移实验显示，5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL的北沙参提取液对H460细胞的迁移能力具有抑制作用，且随药物浓度的提高，抑制作用逐渐增强。见表2。

3.3北沙参提取液抑制H460细胞侵袭能力的影响Matrigel侵袭实验显示，5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL的北沙参提取液对H460细胞的侵袭能力具有抑制作用，且随药物浓度的提高，抑制作用逐渐增强。见表2。

组别迁移细胞数 (个)侵袭细胞数(个)对照组164±14103±85mg/mL组131±9**85±9*10mg/mL组100±11**63±11**15mg/mL组62±5**31±7**

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。

3.4北沙参提取液对H460细胞中TIMP2的表达水平的影响荧光定量PCR结果显示，5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL的北沙参提取液上调了H460细胞中TIMP2的mRNA表达水平，且随药物浓度提高，上调幅度逐渐增大。见表3。

组别相对mRNA表达量对照组1.00±0.005mg/mL组1.37±0.09**10mg/mL组1.65±0.08**15mg/mL组2.04±0.19**

注：与对照组相比，**P<0.01。

3.5北沙参提取液对H460细胞TIMP2的分泌水平的影响ELISA结果显示，5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL的北沙参提取液作用于H460细胞后，其培养液中TIMP2的浓度升高，且升高幅度随药物浓度提高而提高。说明北沙参提取液可以促进肺癌细胞对TIMP2蛋白的分泌。见表4。

表4 北沙参提取液对H460细胞TIMP2蛋白分泌水平的影响

注：与对照组相比，**P<0.01。

4 讨论

已有的抑制肿瘤细胞迁移、侵袭的药物大多具有较强的毒副作用，给患者的肝脏、肾脏和骨髓造成较大的伤害，严重影响其临床整体疗效[6]。北沙参是一味常用中药。已有研究表明：它具有增强巨噬细胞吞噬能力、抗氧化、逆转肺纤维化、抑制肺部感染等多种药理活性[7]。北沙参在很多抗肿瘤方剂中均有应用，但是其确切的抗肿瘤作用机理还不很清楚。本实验证实，北沙参对正常支气管上皮细胞不产生细胞毒作用，同时能够有效抑制肺癌细胞的迁移和侵袭能力。

基质金属蛋白酶是一类胶原酶，它们可以降解细胞外基质中的胶原成分，破坏肿瘤细胞迁移侵袭的组织学屏障。许多肿瘤细胞都分泌大量的基质金属蛋白酶到细胞外空间，以利于自身的迁移和侵袭活动。组织型基质金属蛋白酶抑制剂是一类内源性的基质金属蛋白酶抑制剂，它们以1：1的比例与细胞外空间的基质金属蛋白酶结合，并封闭其降解细胞外基质的活性位点，使其无法发挥促进肿瘤细胞迁移、侵袭的作用[8]。TIMP2是组织型基质金属蛋白酶抑制剂家族的重要成员，是一种重要的抑癌因子。在肺癌细胞中，TIMP2的合成和分泌水平显著降低。本研究中，北沙参作用于肺癌细胞后，有效增强了肺癌细胞对TIMP2的合成和分泌，从而有力抑制了肺癌细胞的迁移和侵袭能力。

本研究从细胞和分子层面探究了北沙参的抗肿瘤作用机理，为北沙参的抗肿瘤临床应用提供了理论依据。所得结果证明，从中药，特别是无毒中药中寻找新型抗肿瘤药物是一个极有前景的方向。