临床待输血患者RhE抗原和不规则抗体的检测及其临床意义

王晓宁，赵 震，刘 冰，李凌波

(1.吉林大学第一医院输血科，吉林 长春 130021；2.吉林省长春市博迅生物技术有限责任公司，吉林 长春130102)

目前已确认的人类血型系统已达36个[1]，Rh系统是其中最复杂的血型系统，包含了54种Rh血型抗原[2]，5种主要抗原Rh，即D、C、E、c和e与临床输血有密切关联，抗原阴性的患者接受相应抗原阳性的供者血液会产生ABO系统以外的抗体，即红细胞不规则抗体，这种抗原抗体的不匹配可导致溶血性输血反应的发生[3]。由于Rh系统具有遗传多态性，不同种族地域人群Rh血型抗原分布频率不尽相同，产生的不规则抗体也具有差异性。研究[4-5]显示：近20年来中国不规则抗体筛查阳性(抗筛阳性)患者人群中以抗-E抗体最多(占33.9%)，抗-E抗体的多发与RhE抗原分布及其不匹配输血有关。目前，国外对红细胞异源免疫的研究多集中在C/c、E/e、K、Fya和Jkb等抗原是否匹配上[6]，而中国人群由于RhE抗原阴性和阳性分布较均衡，导致异源免疫多发生于临床上有免疫史的E抗原阴性人群，如国内已有研究探讨了RhE抗原阴性孕妇妊娠和生产次数与抗-E抗体产生的相关性[7]。与上述研究不同，为了解待输血患者人群RhE抗原分布情况、患者是否有免疫史及其与不规则抗-E抗体产生的关系，本研究采用微柱凝胶法对10 000例住院患者血样进行了RhE抗原检测及不规则抗体筛查和鉴定，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象选择2015年2—12月吉林大学第一医院住院待输血的手术患者、非手术患者、孕妇和部分新生儿血液样本，排除门诊患者及免疫史(输血和/或妊娠史)不明确患者。血液标本共10 000例，其中男性4 856例，女性5 144例；年龄最小1岁，最大97岁；有临床免疫史(输血和妊娠史)患者5 120例，无临床免疫史患者4 880例。

1.2 试剂和仪器ABODE血型检测卡(微柱凝胶)、抗人球蛋白检测卡(不规则抗体筛检)、ABO血型反定型试剂盒(人血红细胞)、不规则抗体检测试剂(人血红细胞)和低离子强度盐溶液(LISS)均由吉林省长春市博迅生物技术有限责任公司生产；红细胞血型抗体鉴定细胞(10人份，所含主要抗原有D、C、E、c、e、M、N、S、s、P1、Lea、Leb、K、k、Fya、Fyb、Jka和Jkb)，由上海血液生物医药有限责任公司生产。以上所有试剂均在效期内使用。FYQ型免疫微柱孵育器和TD-A型血型血清学用离心机由吉林省长春市博研医学生物仪器公司生产。

1.3 方 法①标本ABO、RhD和RhE血型检测：采集患者静脉血样本，患者血样加入含EDTA抗凝剂的试管中。将采集的标本配制成0.8%红细胞生理盐水悬液。将ABODE血型检测卡(微柱凝胶)做标记，按照ABODE血型检测卡(微柱凝胶)说明书操作。使用专用离心机离心5 min(900 r·min-1离心2 min，1 500 r·min-1离心 3 min)，肉眼判定结果。待检者红细胞与抗体结合在微柱凝胶中形成的特异性抗原抗体复合物浮在凝胶表面或胶中为阳性反应，说明待检者红细胞表面有相应的抗原；待检者红细胞不与抗体结合无特异性抗原抗体复合物形成，游离的红细胞沉于微柱凝胶的底部为阴性反应，说明待检者红细胞表面无相应的抗原。②标本不规则抗体筛查：患者静脉血采入无抗凝剂试管中，37℃放置2 h后2 000 r·min-1离心10 min，取上清。使用低离子强度盐溶液(LISS)将1号至3号O型筛选红细胞配制成0.8%悬液，将抗人球蛋白检测卡(不规则抗体筛检)的微管作好标记，按照试剂卡说明书进行操作。试剂卡置于37℃孵育15 min。即刻使用专用离心机离心5 min(900 r·min-1离心2 min，1 500 r·min-1离心3 min)，肉眼判定结果。阴性、阳性结果判断同上。1～3号管均呈阴性结果，表明被检血清中不含有该标准O型筛选红细胞抗原特异性的IgG类不完全抗体；1～3号管中有1管及1管以上呈阳性结果，表明被检者血清中含有该标准O型筛选红细胞抗原特异性的IgG类不完全抗体。③不规则抗体鉴定：检测到不规则抗体为阳性的标本用1～10 号谱细胞进行微柱凝胶法抗体特异性鉴定。采用微柱凝胶抗球蛋白技术分别与由10人份O型红细胞组成的谱红细胞及自身红细胞(均为0.8%低离子悬液)反应。与谱红细胞中1至数人份凝集，与自身红细胞不凝集者为抗体阳性，并根据与谱红细胞的反应格局判定抗体的特异性。与自身红细胞凝集者，应用巯基试剂(2-ME)排除自身冷凝集素。

1.4 统计学分析应用Excel软件建立数据库，采用SPSS 15.0统计软件进行统计学分析。RhE抗原在不同ABO血型中的阴性率比较、不同性别患者不规则抗体的阳性率比较和检出不规则抗体的患者有无临床免疫史(输血和/或妊娠史)的比率均以百分率表示，组间比较采用χ2检验和Fisher精确概率法。以α=0.05为检验水准。

2 结 果

2.1 患者标本RhE抗原检测结果10 000例患者标本中，RhE抗原阳性率51.46%(5 146/10 000)，RhE抗原阴性率48.54%(4 854/10 000)，RhE抗原在不同ABO血型中的阴性率比较差异无统计学意义(χ2=2.107，P=0.550)。见表1。

2.2 患者标本不规则抗体筛查结果 10 000例患者标本中产生不规则抗体者78例，阳性率0.78%。不规则抗体阳性标本中，男性22例，阳性率0.45%(22/4 856)；女性56例，阳性率1.09%(56/5 144)。不同性别患者间比较，女性患者不规则抗体阳性率高于男性(χ2=13.039，P<0.01)。

表1 RhE抗原检测结果及其在ABO不同血型中的分布

2.3 78例不规则抗体阳性患者单一性抗体阳性率及其与临床免疫史(输血史和妊娠史)的关系 78例不规则抗体中红细胞同种抗体68例，自身抗体10例。红细胞同种抗体中Rh系统抗体46例，所占构成比最高(58.97%)。全部抗体中抗-E抗体最多(18例，23.08%)，18例检出抗-E抗体患者中17例有临床免疫史，在有临床免疫史患者中检出率为0.33%(17/5 120)，与无免疫史患者检出率(0.02%,1/4 880)比较差异有统计学意义(χ2=13.497，P<0.01)。检出的全部Rh系统单独抗体在有临床免疫史患者中检出率为0.84%(43/5 120)，与无免疫史患者检出率(0.06%，3/4 880)比较差异有统计学意义(χ2=33.060，P<0.01)。有无临床免疫史患者中抗-M抗体[χ2=1.110(校正)，P=0.500]和自身抗体[χ2=1.810(校正)，P=0.180]检出率比较差异均无统计学意义，其余抗体因检出数过少未行统计学分析。见表2。

表2 单一性抗体阳性率及其与临床免疫史(输血史和妊娠史)的关系

Tab.2 Positive rates of single antibodies and their correlations with clinical immunization history (blood transfusion and pregnancy history)

Antibody n Positive rate(η/%) Immunization historyn Positive rate(η/%) No history of immunizationn Positive rate(η/%)Anti-E18 23.08 17 0.331 0.02Anti-D10 12.82 9 0.181 0.02Anti-cE6 7.696 0.12 0 0.00Anti-C5 6.415 0.100 0.00Anti-e3 3.852 0.041 0.02Anti-c3 3.853 0.060 0.00Anti-Ce1 1.281 0.020 0.00Anti-M8 10.266 0.122 0.04Anti-Leb3 3.851 0.022 0.04Anti-Fya2 2.560 0.002 0.04Anti-Jka2 2.562 0.040 0.00Anti-Dia2 2.562 0.040 0.00Anti-Mur2 2.562 0.040 0.00Anti-N1 1.281 0.020 0.00Anti-C and Anti-M1 1.281 0.020 0.00Anti-E andAnti-Leb1 1.281 0.020 0.00Autoantibody10 12.823 0.067 0.14Total78 100.0062 1.2116 0.33

3 讨 论

红细胞血型不规则抗体一般由人类红细胞作为抗原刺激引起同族免疫作用而产生，输注不配合的血液可以刺激机体产生抗体，尤其是有输血史的患者，可以激活以前不能被检出的抗体再次产生。近年来研究[8-9]显示:红细胞异源免疫是临床依赖输血患者的一个重要并发症，并认为红细胞不规则抗体导致的溶血性输血反应是输血相关死亡的重要原因。鉴于不配合血液输注导致的不规则抗体产生病例呈现的上升趋势，国际输血协会在2011 年发布的关于非传染性输血反应定义的标准中，将非传染性输血反应中的迟发型血清反应(delayed serologic reaction，DSTR)作为3种溶血性输血反应的一种，正式定义为“输血后产生新的具有临床意义的红细胞抗体且不伴有临床和实验室溶血征兆的同种异体免疫反应”[10]。

红细胞不规则抗体中，Rh系统抗体均由免疫刺激产生，而Rh系统抗-E抗体则是近年来中国患者人群中最常检出的抗体[4,11-12]，可能与中国人群RhE抗原阴阳性分布接近及未实现RhE的同型输注有关[5,13]。本研究结果显示:10 000例住院患者标本RhE抗原阴性4 854例，阴性率48.54%，阳性5 146例，阳性率51.46%，与文献[5,13]报道吉林地区患者RhE阴阳性分布基本一致，间接证实了上述研究的部分推论。但RhE抗原在不同ABO血型中的阴性率比较差异无统计学意义，可能与ABO系统和Rh系统均为独立遗传的血型系统有关。

我国2000年版《临床输血技术规范》只要求输血患者常规检测ABO血型(正、反定型)和RhD抗原，对RhE抗原无明确要求。由于我国人群RhE阴性频率远高于RhD阴性频率，患者输血前又无相应的预防措施，从而使RhE抗原阴性患者受同种免疫概率大大增加[13]，产生的不规则抗体常在临床导致疑难配血或造成严重后果。本研究对10 000例患者标本进行了不规则抗体检测并鉴定，发现不规则抗体阳性78例，阳性率0.78%；经鉴定其中Rh系统抗体占58.97%，检出的全部Rh系统单独抗体在有临床免疫史患者中检出率为0.84%(43/5 120)，与无免疫史患者检出率0.06%(3/4 880)比较差异有统计学意义；且在全部检出抗体中抗-E抗体最多(23.08%)，检出的18例抗-E抗体的患者中17例有输血或妊娠史，与无免疫史患者检出率比较差异有统计学意义，表明包括抗-E抗体在内的Rh血型系统抗体主要产生在具有输血和妊娠等临床免疫史患者中，提示对于有输血史和妊娠史的临床患者，应对其进行同种抗体的筛查和鉴定，具备条件时可在这些患者中采用RhE等Rh系统抗原同型输注，以降低机体产生Rh系统同种抗体的概率。

不规则抗体产生的原因为输血和(或)妊娠而产生的红细胞同种免疫。妊娠可产生免疫应答，故女性产生不规则抗体及发生溶血反应的机会大于男性[14]。本研究中，不同性别不规则抗体阳性率不同，女性阳性率高于男性。提示在临床工作中要特别注意需要输血的女性患者，对于非RhD抗原引起的同种免疫反应要引起临床重视。在法国，常规对献血者和受血者进行ABO、Rh和Kell 系统表现型鉴定，并规定对50岁以下女性输血必须实现Rh和Kell系统的匹配(包括RhC、RhE、Rhc、Rhe和K抗原)，以避免不规则抗体产生带来不利后果[15]。近年来，输血相关红细胞同种异源免疫问题在发达国家愈来愈引起重视，一些研究者[9]提出了输血前表现型的扩展性匹配(extended matched，EM)，即将仅ABO、RhD同型匹配扩展到RhC、RhE、Rhc、Rhe、K、Fya、Jka和S等抗原的匹配，可有效防止不规则抗体的形成或形成后带来的负面作用，但这种精准的匹配需立足于大规模的血清学筛查或大规模的基因分型[16]，就使得寻找合适供者的工作变得更加困难，因此目前这种表现型匹配在国外仅应用于特定的患者群体，如镰状细胞性贫血或β-地中海贫血患者等[17-18]。

母亲血型抗体引起的新生儿溶血症及输血的安全性，均以血型抗体为核心。林妈利等[19-20]对于输血前常规筛检血型抗原的问题曾提出根据抗体出现频率的高低，判定其在当地的临床意义，该观点得到国内外输血界的赞同和肯定。对于中国患者而言，鉴于不规则抗-E抗体的多发性，应同白种人预防抗-D抗体类似，做到在输血前对患者和献血者常规检测RhE抗原，对二者RhE抗原准确分型，实现ABO、RhD和RhE的匹配性输血，才可从源头上降低不规则抗-E抗体的阳性率，并避免产生抗-E抗体给患者再次输血带来困难，促进临床输血安全。