菩人丹超微粉对STZ诱导糖尿病大鼠视网膜病变的保护作用及其对NF-κB信号通路的影响

王海彬，董志军，郭立涛，石 晶，董微丽

(承德医学院附属医院眼科，河北 承德 067000)

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病引致视网膜微血管病变和神经组织病变的常见并发症，是导致视力损害的重要原因，近年来DR的发病率呈上升趋势，严重影响患者的生活质量[1]。研究[2-3]表明：血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管生成素2(angiopoietin-2，Ang-2)作为防治DR的重要标志，可反映视网膜组织的损伤程度。另有研究[4-5]表明：晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)/晚期糖基化终末产物受体(receptor of advanced glycation end products，RAGE)/核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信号通路在DR过程中起重要作用。

菩人丹超微粉(Purendan Superfine Powder,简称PRD)是以苦瓜为君药，以人参和丹参为臣药，加以制首乌、水蛭和葛根配伍组成的中药复方，具有益气养阴清热、活血化瘀通络之功效。研究[6]表明：PRD对病机为“热、虚、瘀”的糖尿病患者有明显疗效。但目前尚无有关PRD对DR影响的相关机制的研究。为进一步探讨PRD对DR的保护作用，本研究主要观察PRD对糖尿病模型大鼠视网膜组织中VEGF和Ang-2蛋白表达的影响，并从AGEs/RAGE/NF-κB信号通路探讨PRD对糖尿病大鼠视网膜微血管损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 药物、主要试剂和仪器 PRD(河北以岭药业集团有限公司)，链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)，VEGF和Ang-2引物序列(上海生工生物工程有限公司)，兔抗VEGF 抗体(美国Cell Signalling公司)，Ang-2、AGEs和RAGE抗体(英国Abcam公司)，NF-κB P65(美国CST公司)，抗兔辣根过氧化物酶(HRP，上海长岛生物技术有限公司)。OneTouch®UltraVue血糖仪(上海强生医疗器材有限公司)，电泳仪(西安东澳生物科技有限公司)，图像分析软件Quantity One 4.3.1(美国Bio-rad公司)。

1.2 实验动物、分组和给药 雄性Wistar大鼠40只，SPF级，体质量200～250 g，购自河北省实验动物中心，动物许可证号: SCXK(冀) 2016-0002。适应性喂养1周，实验室温度22℃～28℃，相对湿度60%～78%。40只大鼠随机分为正常对照组、模型组、低剂量PRD组和高剂量PRD组，每组10只。模型组、低剂量PRD组和高剂量PRD组大鼠禁食12 h后，腹腔注射2% STZ(60 mg·kg-1)，每天1次，制备糖尿病动物模型。连续注射3 d后空腹后取鼠尾血，采用血糖仪测定血糖，以血糖水平≥16.7 mmol·L-1为糖尿病大鼠模型建立成功的标准[7-8]。待模型成功建立后，低剂量和高剂量PRD组大鼠分别灌胃给予1.2和2.4 g·kg-1PRD ，大鼠给药剂量根据成人给药剂量按体表面积换算，大鼠每日等效剂量(g·kg-1)=6.3×成人每日剂量(g·kg-1)，自造模成功起连续给药3个月。正常对照组、模型组大鼠分别灌胃给予等体积生理盐水。实验期间大鼠自由进水和进食，不使用胰岛素及其他降糖药物。

1.3 标本收集 大鼠禁食12 h后，腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg·kg-1)麻醉，打开腹腔，腹主动脉置管，取血测定血糖，用生理盐水灌洗至眼球苍白，迅速摘除双眼眼球，去除眼前节及玻璃体，于显微镜下钝性分离视网膜组织，置于-80℃下储存，用于实时定量逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和Western blotting法检测。

1.4 RT-PCR法检测大鼠视网膜组织中VEGF和Ang-2 mRNA表达水平 提取视网膜组织总RNA，按照Thermo公司逆转录试剂盒的方法转录成cDNA，以此为模板进行半定量PCR检测，以β-actin基因的表达作为内参照。目的基因VEGF和Ang-2引物序列见表1。反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，循环35次；72℃延伸10 min。PCR结束后以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增目的基因cDNA片段的质量，凝胶成像系统分析，以PCR产物的DNA扩增条带的灰度值和内参物扩增条带灰度值的比值作为VEGF和Ang-2 mRNA表达水平。

表1 VEGF和Ang-2引物序列

1.5 Western blotting法检测视网膜组织中AGEs、RAGE、NF-кB、VEGF和Ang-2蛋白表达水平 取液氮中保存的视网膜组织，加入PBS(0.01 mmol·L-1，pH7.4)1 mL于匀浆器中冰浴下匀浆， 4℃、6 000 r·min-1离心30 min，弃上清，向沉淀物中加入200 μL全细胞裂解液冰浴裂解 40 min，4℃、12 000 r·min-1高速离心15 min，收集上清液，按照试剂盒方法对蛋白浓度进行定量，蛋白上样量为50 μg，12% SDS-PAGE凝胶电泳，80～120 V、2 h，电泳完毕后转移至PVDF膜(孔径0.45 μm，美国Pall公司)上；5%脱脂奶粉TBST封闭2 h；加入AGEs(1∶1 000)、RAGE(1∶1 000)、NF-κB(1∶1 000)、VEGF(1∶200)和Ang-2(1∶200)抗体，PVDF膜用0.5% TBS-T溶液洗膜3次，每次5 min，用二抗辣根过氧化物酶(HRP,1∶5 000)交联物室温摇床孵育1 h，0.5% TBS-T溶液洗膜3次后，显影，对显影条带进行灰度分析，以GAPDH作为内参，计算AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF和Ang-2条带与GAPDH条带的灰度值比值，代表目的蛋白的表达水平。

2 结 果

2.1 各组大鼠血糖水平 各组大鼠注射STZ造模24 h后出现多食、多饮和多尿表现，48 h后出现体质量下降和行动迟缓。与正常对照组比较，模型组大鼠体质量明显降低(P<0.05)，血糖水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，低和高剂量PRD组大鼠体质量明显升高(P<0.05)，血糖水平明显降低(P<0.05)；与治疗前比较，治疗后低和高剂量PRD组大鼠血糖水平明显降低(P<0.05)，高剂量PRD组较低剂量PRD组降糖效果更佳。见表2。

表2 各组大鼠体质量和血糖水平

GroupBody weight(m/mg)Before treatmentAfter treatmentBlood glucose[cB/(mmol·L-1)]Before treatmentAfter treatmentNormal control224.05±11.55285.94±12.346.10±4.566.67±2.83Model201.41±9.36∗206.31±24.61∗21.74±1.93∗23.74±5.30∗PRD Low dose 204.31±8.04∗253.83±11.29△20.88±2.37∗15.03±2.73△# High dose 203.53±10.34∗275.55±15.36△21.56±2.53∗14.64±2.69△#

*P<0.05 compared with normal control group;△P<0.05 compared with model group;#P<0.05 compared with before treatment.

2.2 各组大鼠视网膜组织中VEGF和Ang-2 mRNA表达水平 与正常对照组比较，模型组大鼠视网膜组织中VEGF和Ang-2 mRNA表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，低和高剂量PRD组大鼠视网膜组织中VEGF和Ang-2 mRNA表达水平明显降低(P<0.05)，高剂量PRD组较低剂量组降低更明显。见图1和表3。

Lane 1: Normal control group;Lane 2: Model group;Lane 3:Low dose of PRD group； Lane 4:High dose of PRD group.

图1 RT-PCR法检测各组大鼠视网膜组织中VEGF和Ang-2 mRNA表达电泳图

Fig.1 Electrophoregram of expressions of VEGF and Ang-2 mRNA in retinal tissue of rats in various groups detected by Western blotting method

表3 各组大鼠视网膜组织中VEGF和Ang-2 mRNA表达水平

GroupVEGF mRNAAng-2 mRNANormal control0.73±0.020.68±0.04Model1.18±0.03∗1.14±0.07∗PRD Low dose 1.08±0.01△0.95±0.05△ High dose 0.90±0.02△0.75±0.04△

*P<0.05 compared with normal control group;△P<0.05 compared with model group.

2.3 各组大鼠视网膜组织中AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF和Ang-2蛋白表达水平 与正常对照组比较，模型组大鼠视网膜组织中AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF和Ang-2蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，低剂量和高剂量PRD组大鼠视网膜AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF和Ang-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，高剂量PRD组较低剂量PRD组降低更明显。见图2和表4。

Lane 1: Normal control group；Lane 2: Model group；Lane 3:Low dose of PRD group ；Lane 4:High dose of PRD group.

图2 Western blotting法检测各组大鼠视网膜组织中AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF和Ang-2蛋白表达电泳图

Fig.2 Electrophoregram of expressions of AGEs,RAGE,NF-κB,VEGF， and Ang-2 proteins in retina tissue of rats in various groups detected by Western blotting method

表4 各组大鼠视网膜组织中AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF和Ang-2蛋白表达水平

GroupsAGEsRAGENF-кBVEGFAng-2Normal control0.29±0.020.33±0.010.45±0.040.48±0.030.42±0.03Model0.46±0.04∗0.59±0.01∗0.91±0.04∗1.01±0.04∗0.95±0.04∗PRD Low dose 0.38±0.02△0.43±0.04△0.74±0.03△0.70±0.01△0.76±0.02△ High dose 0.33±0.01△0.36±0.01△0.64±0.01△0.58±0.02△0.63±0.02△

*P<0.05 compared with normal control group;△P<0.05 compared with model group.

3 讨 论

糖尿病归属为中医“消渴”，病机特点为“阴虚为本，燥热为标；气阴两伤，阴阳俱虚；变证百出，常夹血瘀”，其中“热”“虚”“瘀”为发病的关键[9-10]。中药治疗主要遵循“清热”“补虚”“祛瘀”疗法。PRD由苦瓜、人参、丹参、首乌、水蛭和葛根配伍组成，方中人参、首乌补气养血，丹参、水蛭活血化瘀，苦瓜、葛根清热凉血兼明目，各中药配伍使用，达到清热和营、祛瘀通络的目的。

DR损伤的特征包括内皮细胞功能障碍、血视网膜屏障、视网膜血流量变化、局部缺血和新血管化[11-12]。研究[13]显示：DR的损伤程度与VEGF和Ang-2有密切关联。VEGF是一种血管生成因子和促炎症因子，对视网膜组织血管生成和水肿的发生有明显影响[14]。Ang-2作为一种促血管生成素，与VEGF具有协同作用，可增加视网膜血管通透性，导致视网膜血管内皮细胞功能障碍和慢性炎症的发生[15-16]。本研究结果显示：模型组大鼠视网膜组织中VEGF和Ang-2 mRNA及蛋白表达水平均明显升高，说明模型建立成功；用药后PRD组大鼠血糖水平明显降低，同时VEGF和Ang-2 mRNA及蛋白表达水平降低，且高剂量PRD组大鼠降低更明显，表明PRD对大鼠DR具有显著疗效。

DR过程中，视网膜组织可产生AGEs，AGEs通过增加血管内皮通透性，促进细胞因子释放和活化蛋白激酶，引起炎症反应，导致视网膜组织病变[17]。NF-κB是一种广泛存在于体内多种细胞的核转录因子，调节多种细胞因子的合成与释放，在机体的免疫和炎症反应、凋亡调控等方面发挥重要作用[18]。AGEs特异性受体RAGE属于免疫球蛋白超家族的细胞表面分子，可结合并降解AGEs。研究[19]证明：发生糖尿病和氧化应激时，RAGE 表达可明显升高。AGEs通过与RAGE结合激活NF-κB，同时NF-κB作为RAGE的启动子促进AGEs与RAGE进一步结合，产生正反馈作用[20]。本研究结果显示：PRD可明显降低糖尿病大鼠视网膜组织中AGEs、RAGE和NF-κB蛋白表达水平，表明PRD可降低AGEs的产生，抑制AGEs与RAGE结合，减少NF-κB的分泌，特异性阻断AGEs/RAGE/NF-κB信号通路。

综上所述，PRD对糖尿病大鼠视网膜具有保护作用，下调糖尿病大鼠视网膜组织中VEGF和Ang-2 mRNA及蛋白表达水平，特异性阻断AGEs/RAGE/NF-κB信号通路，减少视网膜微血管渗漏及病理性新生血管生成，减少AGEs形成，减轻炎症反应，是其发挥保护作用的机制之一。