超高效合相色谱-串联质谱法测定口含烟中对羟基苯甲酸酯

2018-07-27边照阳邓惠敏刘珊珊李中皓范子彦唐纲岭

质谱学报 2018年4期

王颖，边照阳，邓惠敏，杨飞，刘珊珊，李中皓，范子彦，唐纲岭

(国家烟草质量监督检验中心，河南郑州 450001)

对羟基苯甲酸酯又称为尼泊尔金酯，包括甲酯、乙酯、丙酯等，是一种广谱、高效的防腐剂，广泛应用于食品、化妆品、药品等领域[1-4]，甚至在婴儿用品(如咬咬胶)中也有检出[5]。对羟基苯甲酸酯具有酚羟基结构，抑菌活性主要来自其分子态，在pH 3～8范围内有较好的抑菌作用[6]，实际中多为几种酯的混合使用。尼泊尔金酯进入人体后，大部分经代谢排出，最初使用时对其毒性认识并不十分明确[7]。1998年，Routledge等[8]首次发现了尼泊尔金酯具有雌激素活性，随后进行的一些暴露学实验也提示该类防腐剂可能与乳腺癌的发病有关[9-10]。欧盟已于2014年开始限制部分尼泊尔金酯类物质应用于化妆品中[11]。不同于日用品，食品中尼泊尔金酯类物质直接进入人体，过多的摄入会导致其代谢不完全而被吸收储存于人体组织中，造成多种疾病的发生。

口含烟是一种无烟气烟草制品，主要通过口腔含服对其吸食。为了保证口感，这类产品的含水率较卷烟高，有的甚至加入大量的保润剂以保持其湿润状态[12]。由于温度较高时极易产生霉菌等腐败物质，因此，会在产品中加入一定量的防腐成分。目前，我国规定食品中此类防腐剂的限量为10～1 500 mg/kg(按照不同的对羟基苯甲酸酯分类，且以对羟基苯甲酸盐计)，而国际上关于口含烟成分安全监控研究的报道较少。因此，尼泊尔金酯等防腐剂的准确检测具有重要的意义。

尼泊尔金酯类物质的检测方法包括毛细管电泳[13]、气相色谱[14-15]、气相色谱-质谱[5,16]、液相色谱[17]、液相色谱-串联质谱[18-20]等技术。其中，气相色谱法的检测灵敏度较低；气相色谱-质谱法在测定之前需要对样品进行衍生化处理，操作繁琐；液相色谱法和液相色谱-串联质谱法均可实现尼泊尔金酯类物质的准确测定，但液相色谱法需要使用大量的有机溶剂，对操作者和环境的危害较大。合相色谱是2012年由Waters公司推出的全新色谱技术，其主要的流动相为压缩二氧化碳(CO2)，与液体流动相或载气相比，降低了成本和毒性，且分析速度快，与质谱联用可以进一步提高检测的灵敏度和准确度。

本研究拟采用乙腈提取，超高效合相色谱-串联质谱法(UPC2-MS/MS)测定口含烟中尼泊尔金酯类物质，希望为该类物质的检测提供新途径。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

Acquity UPC2Xevo超高效合相色谱-串联质谱仪(配有电喷雾离子源)、Acquity UPC2 TMHSS C18 SB色谱柱(3.0 mm×100 mm×1.8 μm)、Acquity UPC2 TMBEH 2-EP色谱柱(3.0 mm×100 mm×1.7 μm)、Acquity UPC2 TMBEH色谱柱(3.0 mm×100 mm×1.7 μm)、Acquity UPC2 TMCSHTMFluoro-Phenyl色谱柱(3.0 mm×100 mm×1.7 μm)：均为美国Waters公司产品；KQ700-DB超声波发生器：江苏昆山超声仪器公司产品；XH-D漩涡混合器：无锡沃信仪器有限公司产品；Sigma 3-30 K冷冻高速离心机：德国Sigma公司产品；0.22 μm尼龙滤头：上海安谱公司产品；BSA2245-CW电子天平(感量0.1 mg)：德国Sartorius公司产品。

1.2 材料与试剂

甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈：均为色谱纯，美国Tedia公司产品；对羟基苯甲酸甲酯(MPB)、对羟基苯甲酸乙酯(EPB)、对羟基苯甲酸丙酯(PPB)、对羟基苯甲酸丁酯(DPB)：纯度均大于99%，上海安谱公司产品；氘代-对羟基苯甲酸甲酯(D4-MPB)：纯度大于99%，德国Dr. EHrenstorfer GmbH公司产品；HLB固相萃取小柱：美国Waters公司产品；Sigmole EN 3008(25 mg PSA，2.5 mg GCB，150 mg MgSO4)萃取试剂盒：上海科醚化学科技有限公司产品；BondElut 5982-5021(25 mg PSA，150 mg MgSO4)和BondElut 5982-5321(25 mg PSA，7.5 mg Carbon，150 mg MgSO4)萃取试剂盒：美国Agilent科技有限公司产品。

1.3 标准溶液的配制

分别准确称取约0.05 g MPB、EPB、PPB、DPB于烧杯中，加入乙腈溶解，转移至50 mL容量瓶中，用乙腈定容，得到1 g/L的标准储备液。

向2.5 mg氘代对羟基苯甲酸甲酯加入25 mL乙腈，得到100 mg/L的内标标准储备液。

1.4 样品前处理

剪开袋装口含烟的包装，准确称取约1 g(精确至0.000 1 g)样品至50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，再加入50 μL内标溶液，超声提取30 min，以10 000 r/min离心2 min。取1～1.5 mL上清液至含有QuEChERS试剂(25 mg PSA、7.5 mg Carbon、150 mg MgSO4)的离心管中，涡旋混合1～2 min，以10 000 r/min离心1 min，取上清液，过0.22 μm尼龙滤膜，待测。

1.5 实验条件

1.5.1色谱条件色谱柱：Waters Acquity UPC2 TMHSS C18 SB柱(3.0 mm×100 mm×1.8 μm)；柱温55 ℃；流动相：A为CO2，B为异丙醇-甲醇溶液(V/V，1∶1)；流速1.5 mL/min；梯度洗脱程序：0～3.0 min(98%A)，3～3.2 min(98%～92%A)，3.2～4.0 min(92%～98%A)，4.0～5.0 min(98%A)；进样体积1 μL；动态备压1.03×107Pa；补偿液：0.1%甲酸水溶液；流速0.2 mL/min。

1.5.2质谱条件电喷雾离子源(ESI)负离子模式；质量扫描范围m/z50～250；离子源温度150 ℃；毛细管电压3.0 kV；脱溶剂气温度400 ℃；脱溶剂气流速600 L/h；反吹气流速50 L/h；多反应监测模式。具体质谱条件列于表1。

表1 各化合物基本信息和质谱测定条件Table 1 Standard information of the compounds and optimized conditions of mass spectrometry

注：*表示定量离子

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

选取合相色谱最常用的4种分析柱测定标准溶液，结果示于图1。由图1可知，采用UPC2 TMCSHTMFluoro-Phenyl色谱柱(图1a)和UPC2 TMBEH 2-EP色谱柱(图1b)无法完全分离4种成分。4种成分在UPC2 TMBEH 2-EP色谱柱上的响应较低，灵敏度较差。采用Acquity UPC2 TMBEH色谱柱(图1c)时，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯无法分离。在UPC2 TMHSS C18 SB色谱柱上(图1d)，4种成分实现分离，峰形对称、尖锐，有利于定量分析。因此，本实验选择 UPC2 TMHSS C18 SB色谱柱对样品进行分离。

2.2 改性剂的选择

在合相色谱分析中，主要的流动相为非极性超临界CO2，通过在CO2中加入一定量的液体助剂(也称为改性剂)，可以适当的改变流动相性质，从而改变其对化合物的洗脱能力，改善各化合物的峰形和分离情况。实验考察了甲醇、乙腈、异丙醇、甲醇-异丙醇(V/V，1∶1)等改性剂对分离的影响，示于图2。结果表明，甲醇、乙腈和异丙醇不能实现所有成分的良好分离；而采用甲醇-异丙醇(V/V，1∶1)时，4种成分得到了较好分离。因此，本实验选取甲醇-异丙醇(V/V，1∶1)作为改性剂。

2.3 柱温的选择

超临界流体的黏度会随着温度升高而降低，导致溶剂化能力减小，出峰延时，所以相对于液相色谱的流动相，温度对合相色谱的流动相——超临界状态下的CO2影响更大。合相色谱柱温的范围一般为10～60 ℃。实验考察了15～60 ℃柱温对目标物分离的影响。结果表明，当柱温小于55 ℃时，各化合物出峰较快，部分物质难以分离；当柱温为55 ℃时，各化合物分离度较好，峰形对称；当柱温继续升高，各化合物保留时间没有明显提高，且分离度变化不大。因此，本实验选取柱温55 ℃对样品进行测定。

2.4 动态备压的选择

合相色谱动态备压控制整个操作过程中CO2的超临界流体状态，是影响分离过程的重要因素之一。实验考察了动态备压在1.03×107～1.37×107Pa范围内对目标物分离的影响。当动态备压由1.03×107Pa逐渐上升时，各化合物分离度开始呈缓慢下降趋势；升至1.10×107Pa及以上时，分离度下降较快。因此，选择动态备压1.03×107Pa，此时，系统压力不大，4种化合物分离良好。

注：a.UPC2 TM CSHTM Fluoro-Phenyl色谱柱；b.UPC2 TM BEH 2-EP色谱柱；c.Acquity UPC2 TM BEH色谱柱；d.UPC2 TM HSS C18 SB色谱柱；1.对羟基苯甲酸甲酯；2.对羟基苯甲酸乙酯；3.对羟基苯甲酸丙酯；4.对羟基苯甲酸丁酯图1 4种色谱柱上标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatograms of standard solution on 4 kinds of column

注：a.甲醇；b.乙腈；c.异丙醇；d.甲醇-异丙醇(V/V，1∶1)图2 改性剂的选择对分离的影响Fig.2 Effect of the selection of modifiers on separation

2.5 萃取溶剂的选择

对羟基苯甲酸酯类物质微溶于水，易溶于甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈等有机溶剂。甲醇[20-21]和乙腈是文献中常用的提取溶剂，但提取前都要加盐，如NaCl[22]或Na2SO4[23]，这主要是因为糖类和蛋白质等物质会在有机溶剂中聚集成团，使得目标分析物被样品颗粒包裹，降低了提取效率。口含烟中烟草、蛋白质和糖类等物质的含量均较高，并且由于制作工艺的不同，其水分和盐的含量比普通烟草高很多。实验考察了甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈对样品的提取效率。结果表明，相较于乙醇和异丙醇，甲醇和乙腈的提取效率均较高，但是甲醇提取的样品色素含量较高，因此，选择乙腈为萃取溶剂。另外，实验考察加入Na2SO4对提取效率的影响，发现加入Na2SO4后提取效率变化不大，这可能是因为口含烟本身的含盐量较高，不需外加盐即可直接提取。

2.6 样品净化条件的选择

质谱分析中，相较于其他类型的离子源，电喷雾离子源更易产生基质效应。净化样品可以有效地降低基质效应，是前处理过程的重要环节。实验考察了固相萃取(SPE)和QuEChERS方法对样品的净化效果。采用的固相萃取小柱为Thermo Fisher OnGuard RP柱、Waters Oasis HLB 柱，采用的QuEChERS萃取试剂盒为Sigmole EN 3008(25 mg PSA，2.5 mg GCB，150 mg MgSO4)、BondElut 5982-5021(25 mg PSA，150 mg MgSO4)、BondElut 5982-5321(25 mg PSA，7.5 mg Carbon，150 mg MgSO4)，结果示于图3。由图3可知，2种固相萃取小柱和BondElut 5982-5021试剂盒处理后的样品回收率差别不大；采用Sigmole EN 3008试剂盒处理后的样品回收率有所提高；当增加QuEChERS试剂盒中碳含量，即采用BondElut 5982-5321试剂盒对样品进行处理时，回收率较为满意。石墨化碳主要去除样品中色素，说明色素类物质对测定的干扰较大。实验最终选择BondElut 5982-5321试剂盒对样品进行净化。

2.7 方法学验证

2.7.1加标回收率和精密度选取口含烟样品进行低、中、高加标水平回收率实验，加标量分别为50、100、200 μg/L，每个水平平行测定3次。将不加标样品平行测定6次，计算平均相对标准偏差(RSD)，结果列于表2。可见，低、中、高加标水平条件下的回收率为94.6%～105.6%；4种成分6次平行测定的RSD为2.14%～3.95%。

图3 不同净化条件对回收率的影响Fig.3 Effect of different sorbents on the recoveries

2.7.2线性关系、定量限和检出限用乙腈稀释1.3节中的标准储备液，分别配制浓度为50、80、100、200、300、500 μg/L的标准工作溶液(内标加入量为50 μL)。采用优化后的UPC2-MS/MS条件进行分析测定，以待测物的浓度为横坐标，待测物与内标的峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线。分别以信噪比S/N=3和S/N=10计算方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)，其线性范围、相关系数、检出限、定量限列于表3。

2.8 实际样品的测定

选取10种市售口含烟样品，采用优化后的条件进行测试，结果示于图4。结果表明，在多个样品中均检出对羟基苯甲酸酯类防腐剂，较常见的是对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯的混合使用，仅在1个样品中同时检出4种成分。从定量角度看，所有样品中单个成分的含量和多种成分的总含量均小于10 mg/kg，低于我国对于食品中此类防腐剂的添加限量要求。但是，鉴于欧盟对此类物质日益严格的限制，今后对此类物质的使用需持谨慎态度。