OPG和RANKL在XACB/LV⁃bFGF/MSCs移植修复兔股骨头缺损坏死模型中的表达

赵胤 彭吾训 张健 董文涛 吴建华 张飞 张槐 王健波 叶川李青 邓进

1贵州医科大学（贵阳 550000）；2贵州医科大学附属医院（贵阳 550000）

股骨头缺血性坏死（avascular necrosis of femo⁃ral head，ANFH）多见于20～50岁的中青年患者，是由于不同病因破坏了股骨头的血液供应所造成的最终结果。目前公认的致病因素有13种［1］，这些致病因素破坏股骨头的血液供应，最终导致股骨头骨与软骨细胞的坏死及关节面的坍塌，是临床常见的疾病之一。目前针对股骨头缺血性坏死有髓芯减压术［2］、带血管蒂游离腓骨移植［3］、人工髋关节置换等治疗措施，但却存在治愈率低、供骨区并发症、人工关节使用寿命有限等缺点［4］。近年来，运用骨髓基质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植修复股骨头缺血性坏死成为研究热点，骨髓基质干细胞是多能干细胞，具有分化为成骨细胞的潜力［5］，而在诱导骨髓基质干细胞定向分化为成骨细胞的过程中，常用的细胞因子为碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）［6］。而骨保护素和核因子⁃κB受体活化因子配体作为破骨细胞分化和调节骨吸收的关键因子［7］，可直接影响破骨细胞功效，是骨质吸收的共同通路。本文就通过观察移植了慢病毒转染bFGF的MSCs复合培养的异种脱抗原松质骨（XACB/LV⁃bFGF/MSCs）治疗兔股骨头坏死模型中骨保护素和核因子-κB受体活化因子配体的表达变化情况，探讨组织工程骨对股骨头缺损坏死的治疗效果，为将来骨组织工程的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6～7月龄纯种雄性新西兰大白兔60只，由贵州医科大学动物中心提供。

1.2 主要实验试剂及仪器 兔抗bFGF多克隆抗体，兔抗OPG多克隆抗体，兔抗RANKL多克隆抗体（北京博奥森生物科技有限公司）；FGF⁃2基因过表达慢病毒和慢病毒阴性对照（上海吉凯基因有限公司）。

1.3 兔BMSCs分离培养及鉴定 以3%戊巴比妥钠静脉麻醉后，在兔股骨远端及胫骨近端穿刺，以预存肝素的注射器抽取骨髓液1～2 mL，采用密度梯度离心法分离细胞，完全培养基重悬，接种于25 cm2培养瓶中，置于5%CO2、37℃培养箱中培养。每天倒置显微镜下观察细胞形态及贴壁情况，当细胞接近80%～90%融合时，加入胰酶按1∶3的比例消化传代。细胞传至第3代时，应用流式细胞仪检测MSCs细胞表面标记物（CD44）的表达；采用成骨诱导培养基诱导MSCs成骨分化，于诱导培养第14天，应用ALP染色和茜素红染色鉴定其成骨分化潜能。

1.4 组织工程骨的制备 用猪椎骨制成异种脱抗原松质骨（XACB）。分离培养兔骨髓基质干细胞（MSCs）并传代培养，将兔bFGF基因通过慢病毒转染至骨髓基质干细胞。将含兔bFGF基因的MSCs与XACB复合培养，制成组织工程骨XACB/LV⁃bFGF/MSCs。

1.5 建立兔股骨头坏死模型 雄性新西兰大白兔60只进行随机分组，分为5组，每组12只，运用MATSUI等［8］的地塞米松联合马血清注射的方法进行造模。

1.6 实验分组与组织工程骨的植入 造模结束后行MRI检查，确认造模成功后均右侧手术。将实验动物随机分为5组。A组为空白对照组，B组植入XACB，C组植入XACB+MSCs，D组植入XACB+MSCs+空病毒，E组植入XACB+LV⁃bFGF+MSCs。每组12只。A组复温后立即逐层关闭切口，B、C、D、E、组复温后沿向钻孔内分别植入面积3 mm×3 mm×3 mm大小的XACB、XACB+MSCs、XACB+MSCs+ 空病毒、XACB+bFGF+MSCs，医用凝胶海绵封闭创面，逐层关闭切口。术后各组动物臀大肌注射青霉素钠（40万U/d，连续3 d）预防感染。

1.7 Western blot法检测慢病毒转染的骨髓基制干细胞中bFGF蛋白表达水平 转染之前将细胞分为3组，分别为实验组（MSCs+LV⁃bFGF），空病毒组（MSCs+空病毒），空白组（单纯MSCs）。转染后将3组MSCs消化后提取蛋白，运用BCA法测定蛋白浓度，调节蛋白浓度一致后100℃煮沸10 min使蛋白变性。按照WB的实验步骤进行操作，得出的图像运用凝胶图像处理系统分析图像。

1.8 Western blot法检测骨组织中OPG和RANKL蛋白表达水平 术后3、6、12周各组分别处死四只兔子，加入蛋白裂解液（按每100 mg骨组织加入200 μL裂解液）在冰上裂解骨组织，12 000 r/min，4℃离心15 min，取上清即为含有总蛋白的提取液。运用BCA法测定蛋白浓度，调节蛋白浓度一致后100℃煮沸10 min使蛋白变性。按照WB的实验步骤进行操作，得出的图像运用凝胶图像处理系统分析图像。

1.9 统计学方法 所有数据采用SPSS 22.0统计软件包进行分析处理，采用均值比较和单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MSCs的培养与鉴定 采用密度梯度离心法联合贴壁培养法，获得大量形态均一的MSCs，细胞呈旋涡状生长，形状呈长梭形、多角形。细胞表面抗原CD44检测结果阳性率达99%以上；成骨诱导培养第14天，茜素红、ALP染色均呈阳性。见图1。

图1 MSCs的培养与鉴定Fig.1 Culture and authentication of MSCs

2.2 LV⁃bFGF/MSCs中bFGF蛋白表达情况 各组bFGF蛋白表达结果见表1、图2。实验结果显示：实验组与空病毒组和空白组之间两两比较差异均具有统计学意义（P＜0.05），空病毒组与空白组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 LV⁃bFGF/BMSCs中bFGF蛋白表达情况Tab.1 Expression of bFGF protein in LV⁃bFGF/BMSCs ±s

表1 LV⁃bFGF/BMSCs中bFGF蛋白表达情况Tab.1 Expression of bFGF protein in LV⁃bFGF/BMSCs ±s

注：与实验组比较，*P＜0.05；与空病毒组比，#P＞0.05

组别实验组空病毒组空白组bFGF 0.580 2±0.002 2 0.224 7±0.008 2*0.212 8±0.017 5*#

图2 LV⁃bFGF/BMSCs中bFGF蛋白表达情况Fig.2 Expression of bFGF protein in lv⁃bfgf/BMSCs

2.3 骨组织中OPG蛋白表达情况 各组OPG蛋白表达结果见表2、图3。实验结果显示：A、B、C、D组与E组之间两两比较差异有统计学意义（P＜0.05），C组与D组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 骨组织中OPG蛋白表达情况Tab.2 Expression of OPG protein in bone tissue ±s

表2 骨组织中OPG蛋白表达情况Tab.2 Expression of OPG protein in bone tissue ±s

注：与E组比较，*P＜0.05；与D组比，#P＞0.05

组别A组（空白组）B组（XACB）C组（XACB+MSCs）D组（XACB+MSCs+LV）E组（XACB+LV⁃bFGF+MSCs）3周0.517 0±0.020 8*0.102 3±0.015 3*0.157 0±0.050 0*#0.160 7±0.055 1*0.182 7±0.047 3 6周0.057 1±0.001 4*0.106 3±0.005 8*0.160 3±0.005 0*#0.166 3±0.005 1*#0.200 7±0.006 0 12周0.069 0±0.001 0*0.113 3±0.002 3*0.163 7±0.003 2*#0.169 7±0.009 6*0.222 3±0.006 6

图3 骨组织中OPG蛋白表达情况Fig.3 Expression of OPG protein in bone tissue

2.4 骨组织中RANKL蛋白表达情况 各组RANKL蛋白表达结果见表3、图4。实验结果显示：A、B、C、D组与E组之间两两比较差异有统计学意义（P＜0.05）。C组与D组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 骨组织中bFGF蛋白表达情况 各组bFGF蛋白表达结果见表4、图5。实验结果显示：A、B、C、D组与E组之间两两比较差异有统计学意义（P＜0.05）。C组与D组之间比较差异不具有显著性（P＞0.05）。

表3 骨组织中RANKL蛋白表达情况Tab.3 Expression of RANKL protein in bone tissue ±s

表3 骨组织中RANKL蛋白表达情况Tab.3 Expression of RANKL protein in bone tissue ±s

注：与E组比较，*P＜0.05；与D组比，#P＞0.05

组别A组（空白组）B组（XACB）C组（XACB+MSCs）D组（XACB+MSCs+LV）E组（XACB+LV⁃bFGF+MSCs）L3周0.041 8±0.002 7*0.048 9±0.001 4*0.057 4±0.002 9*#0.056 8±0.005 5*0.076 2±0.004 1 L6周0.045 0±0.004 2*0.054 3±0.005 1*0.070 9±0.003 7*#0.075 0±0.001 9*0.093 5±0.004 4 L12周0.056 5±0.002 5*0.065 7±0.005 0*0.078 9±0.004 8*#0.078 8±0.005 0*0.107 0±0.005 2

图4 骨组织中RANKL蛋白表达情况Fig.4 Expression of RANKL protein in bone tissue

3 讨论

3.1 OPG/RANK/RANKL系统 骨头生长、发育是一个高度依赖机体调节的过程。在细胞水平上依赖于促进骨骼生长的成骨细胞和促进骨吸收的破骨细胞之间的相互作用［9］。而 OPG、RANK、RANKL在此过程中发挥重要作用。OPG、RANK、RANKL系统是近年来发现调节骨代谢的重要通路，目前已作为主要的标志物广泛用于骨代谢的研究［10］。OPG是一种生长因子受体，属于肿瘤坏死因子受体家族。OPG是RANKL的诱导受体，通过与RANKL的结合减少破骨细胞的产生。RANKL在成骨细胞中表达，激活破骨细胞。RANKL过表达，可导致一系列骨疾病，如风湿性关节炎、银屑病性关节炎等。本实验中，笔者通过对术后3、6、12周各时间点各组实验动物骨组织中OPG及RANKL的蛋白表达变化情况来评价股骨头坏死的修复效果。本实验采用WB技术检测术后3、6、12周各组实验动物蛋白的表达情况，发现XACB/LV⁃bFGF/MSCs在术后各时间点使OPG表达上调（A、B、C、D组与E组之间两两比较差异均有统计学意义P＜0.05，C组与D组之间比较差异无统计学意义P＞0.05），术后各时间点RANKL蛋白的表达增高（A、B、C、D组与E组之间两两比较差异均有统计学意义P＜0.05，C组与D组之间比较差异无统计学意义P＞0.05），且OPG蛋白表达量高于RANKL蛋白表达量，实验结果表明XACB/LV⁃bFGF/MSCs能够有效促进股骨头坏死的修复。

表4 骨组织中bFGF蛋白表达情况Tab.4 Expression of bFGF protein in bone tissue ±s

表4 骨组织中bFGF蛋白表达情况Tab.4 Expression of bFGF protein in bone tissue ±s

注：与E组比较，*P＜0.05；与D组比，#P＞0.05

组别A组（空白组）B组（XACB）C组（XACB+MSCs）D组（XACB+MSCs+LV）E组（XACB+LV⁃bFGF+MSCs）3周0.047 8±0.002 0*0.066 1±0.001 8*0.091 1±0.002 5*#0.095 0±0.003 7*0.121 3±0.005 5 6周0.129 3±0.011 1*0.143 7±0.007 3*0.164 3±0.003 5*#0.170 0±0.007 9*0.226 3±0.006 6 12周0.152 7±0.008 0*0.186 7±0.003 0*0.257 3±0.010 7*#0.259 0±0.015 1*0.318 3±0.014 1

图5 骨组织中bFGF蛋白表达情况Fig.5 Expression of bFGF protein in bone tissue

3.2 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） 即FGF⁃2，是一种促细胞分裂的肝素结合蛋白，可诱导多种细胞的增殖与分化，被认为是体内最为有效的促血管生成因子之一［11-12］。另外，bFGF还有促进毛细血管生长，促进新骨形成和替代的作用［13-14］。本实验运用WB技术检测慢病毒转染后的骨髓基制干细胞中bFGF的表达情况，以此来验证转染后的MSCs中bFGF的表达量是否增高，实验结果示实验组、空病毒组和空白组均有bFGF蛋白表达，且为实验组＞空病毒组＞空白组，实验组与空病毒组和空白组之间两两比较差异均具有统计学意义（P＜0.05），空病毒组与空白组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。实验结果表明成功通过慢病毒将bFGF转染至MSCs中。以上的实验结果表明：本实验成功地通过慢病毒将bFGF转染至MSCs中，并且XACB/LV⁃bFGF/MSCs组对兔股骨头缺损坏死模型的修复效果较其他组更优，有望作为一种有效的组织工程材料运用于股骨头坏死修复中。

3.3 本实验的局限性和不足之处 本实验仅就慢病毒转染bFGF的MSCs复合培养XACB对兔股骨头坏死的修复效果进行了探索研究，并没有进行相关的抑制实验，同时本实验仅针对实验动物进行了研究，没有对其在人体内的使用效果及作用机制进行研究，因此，下一步笔者还将进行相关的抑制实验以及对XACB/LV⁃bFGF/MSCs在人体内的使用效果及作用机制进行进一步的探索研究。