ARMS法和Sanger测序法检测晚期肺腺癌小标本EGFR基因突变分析

梁继珍 苏宁 谢亚琳 易基群

广州市红十字会医院肿瘤科（广州 510220）；2广州市胸科医院肿瘤科（广州510095）

肺癌是目前发病率和病死率最高的恶性肿瘤，75%的患者在诊断时就已经是局部晚期或远处转移［1］，其中腺癌是肺癌中最常见的亚型。在接受全身化疗的晚期非小细胞肺癌患者中，有80%的患者仅仅通过小活检标本或细胞学样本明确诊断［2］。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）等驱动基因检测是肺癌分子诊断的重要组成部分，而其检测方法众多，目前在临床应用最广泛的检测方法包括ARMS（amplification refractory mutation system）法和Sanger测序法［3-4］。理论上前者灵敏度及特异度均较高，但二者在临床小样本检测中的差异未见相关报道。结合目前临床晚期肺癌的病理标本绝大多数为小组织样本的现状，有必要对二者检测晚期肺腺癌小样本EGFR基因突变的价值进行比较。

本研究拟通过ARMS法和Sanger测序法对近3年晚期肺腺癌小标本组织进行EGFR基因突变检测，回顾性分析2种检测方法EGFR基因的各自分布，及其与临床病理特征的关系，并对其二者的检测结果一致性进行初步比较。

1 对象与方法

1.1 研究对象 筛选并回顾性收集广州市红十字会医院和广州市胸科医院2013年1月至2016年12月初诊晚期肺腺癌病历资料。收集的临床病理资料包括年龄、性别、吸烟史、活检部位、活检方法、标本性质、原发肿瘤分期、淋巴结分期、远处转移分期、TNM分期。共收集到ARMS法检测标本102例、Sanger测序法检测标本138例，其中39例标本进行了上述2种方法的检测。临床分期根据IASLC 2009年制定的NSCLC分期标准进行评定。吸烟史在患者初诊时采集，分为：（1）非吸烟（吸烟≤ 100支）；（2）吸烟（吸烟＞100支）。所有患者已经被告知并同意使用其标本用于基因检测。试验已获得医院伦理委员会的批准。

1.2 标本采集 本研究纳入的小标本通过以下方式获取：（1）支气管镜活检；（2）经皮肺穿刺活检；（3）经皮胸膜穿刺活检；（4）浅表淋巴结/皮下结节部分切取或完整切除标本。组织活检后经10%福尔马林固定并石蜡包埋后，切取4 μm载玻片用于病理分析及基因检测。

1.3 EGFR基因检测 EGFR基因分别使用ARMS法和测序法进行检测。大致过程如下：（1）病理评估：2位病理科医生分别核对石蜡组织的HE染色玻片，确保肿瘤组织比例＞50%，切取每片4 μm厚的切片10张用于后续检测；（2）DNA提取：使用DNeasy Blood and Tissue Kit（No.69504；Qiagen，Valencia，CA）提取肿瘤组织DNA；（3）EGFR检测：ARMS法使用AmoyDx人类EGFR基因21种突变检测试剂盒（No.ADx⁃EG01；厦门艾德）在Lightcycler 480（罗氏公司）仪器进行；测序法使用4组引物对EGFR外显子18-21进行PCR扩增，使用Big Dye Terminator Version 3.1循环测序试剂盒（Applied Biosystems）和 ABI3700 genetic analyzer（Applied Biosystems）进行正向和反向测序。

1.4 统计学方法 采用SPSS 24.0软件进行。计数资料采用例数（百分比）描述，组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率法，计量资料采用描述，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ARMS法检测EGFR结果及其与临床病理特征的关系 ARMS法检测102例样本，EGFR突变占47例（46.1%）、野生型55例（53.9%），其中外显子19 del突变26例（25.5%）、外显子21 L858R突变17例（16.7%）、外显子19 del、21 L858R双突变及外显子19 del、21 L861Q双突变各1例（1.0%）、其他突变2例（2.0%）（图1）。EGFR基因突变与各临床病理特征之间的关系如表1所示。统计分析提示女性EGFR基因突变率高于男性（61.9%vs.35.0%，P=0.007），而非吸烟与吸烟EGFR基因突变未见显著差异（52.5%vs.36.6%，P=0.115）。EGFR基因突变与年龄、活检部位、活检方法、标本性质、原发肿瘤、淋巴结、远处转移、分期无关（P＞0.05）。

图1 晚期肺腺癌小标本EGFR基因突变（ARMS法，102例）Fig.1 EGFR mutation by ARMS method in small specimen of advanced lung adenocarcinoma（n=102）

2.2 Sanger测序法检测EGFR结果及其与临床病理特征的关系 138例样本进行测序法EGFR基因突变检测结果如图2。EGFR突变52例（37.7%），其中外显子19 del突变22例（15.9%）、外显子21 L858R突变19例（13.8%）、其他突变11例（8.0%）。不同活检部位间的EGFR基因突变存在一定的差异（P=0.049），而EGFR基因突变与年龄、性别、吸烟状态、活检方法、标本性质、原发肿瘤、淋巴结、远处转移、分期均无关（P＞0.05）（表2）。女性与男性、非吸烟与吸烟EGFR基因率突变分别为46.4%vs.31.7%（P=0.080）、40.3%vs.34.8%（P=0.511）。

2.3 ARMS法和Sanger测序法比较EGFR基因的一致性 39例标本进行了ARMS法和测序法2种方法检测，EGFR基因突变的一致率为64.1%（25/39）（表3）。一致性分析提示两种EGFR基因检测方法的结果具有中等的一致性，Kappa系数等于0.499（P＜ 0.001）。

3 讨论

NCCN指南推荐根据是否存在EGFR等驱动基因事件指导晚期肺腺癌的一线治疗，且不同EGFR突变类型间靶向药物治疗的疗效也存在差异［5］，故准确检测肺腺癌患者EGFR基因突变，有助于晚期肺癌患者的个体化治疗。EGFR基因突变与众多因素有关，包括临床因素、检测方法、标本因素和异质性等［6］。

表1 ARMS法晚期肺腺癌EGFR基因突变与临床病理特征的关系Tab.1 The relationship between EGFR mutation in advanced lung adenocarcinoma by ARMS method and clinical pathologic features 例（%）

图2 晚期肺腺癌小标本EGFR基因突变（测序法，138例）Fig.2 EGFR mutation by sequencing method in small specimen of advanced lung adenocarcinoma（n=138）

Sanger测序法和ARMS法是EGFR基因检测最经典和最广泛应用的方法。前者能检测到10%～20%及以上的EGFR突变细胞，而ARMS法可检测出组织中0.1%～1%的突变体［3-4］。当样本中DNA难以达到分光光度法所能检测的最低限度时，小剂量低比例的肿瘤衍生DNA常被测序法误判为EGFR野生型［7］。有研究认为测序法可能漏掉25%的突变阳性病例［8］。而有研究证实EGFR基因突变还存在量上的差异即高丰度和低丰度，二者使用靶向治疗的疗效也不存在差异［9］。

检测样本的选择也是影响检测的重要因素。理想的检测样本是新鲜肿瘤组织或冰冻肿瘤组织。而临床诊断的肿瘤组织标本通常经由福尔马林固定并包埋于石蜡中，此过程会破坏核酸的完整性，尤其是福尔马林固定超过24 h或者蜡块保存超过3年的组织［10］。另外，微创技术的应用和医学伦理的要求使得晚期肺癌的活检样本也越来越小。目前基因检测所需的最少恶性肿瘤细胞数目尚无定论，推荐选择至少含有200～400个肿瘤细胞的较大样本进行基因检测［11］。随着技术手段的进步，目前用于EGFR基因检测的样本日益多样化，包括手术切除标本、小活检样本、胸水样本、外周血样本等；有研究显示使用ARMS法对恶性胸腔积液中EGFR基因检测，其突变率为54.5%，低于组织样本检测［12］。

本研究分别使用ARMS法和测序法检测102例和139例肺腺癌小标本EGFR基因突变，二者的EGFR突变率分别为46.1%和37.7%。临床特征分析提示女性ARMS法EGFR基因突变阳性率显著高于男性；在ARMS法不同吸烟状况，测序法不同性别，测序法不同吸烟状况之间EGFR突变虽未达到统计学差异，但仍能看出在肺腺癌小标本EGFR突变在不同性别及吸烟状况间存在差异的趋势。对比国内研究，使用ARMS法检测119例肺腺癌标本，突变率为49.58%，在女性及不吸烟患者中突变率较高［13］。本研究的结果与其相似。标本类型方面，本研究选择了4种不同类型的小标本进行检测，分析不同标本类型、活检方式的EGFR突变的差异。笔者注意到测序法不同活检部位之间的EGFR突变阳性率达到了统计学差异（P=0.049），但此结果可能为样本选择误差所致。通过39例完成测序法和ARMS法EGFR基因突变检测样本的比较，二者EGFR基因突变具有中等的一致性。需注意到3例胸膜活检的样本中存在2例（66.7%）的不一致，提示对于一些肿瘤细胞较少的样本使用较敏感方法检测的必要性。本研究由于是在两个不同的实验室使用不同的标本、不同的检测方法进行的，产生上述差异的原因，还需考虑到肿瘤组织内的异质性［14］。

表2 Sanger测序法晚期肺腺癌小标本EGFR基因突变与临床病理特征的关系Tab.2 The relationship between EGFR mutation in advanced lung adenocarcinoma by sequencing method and clinical pathologic features 例（%）

表3 ARMS法与测序法晚期肺腺癌小标本EGFR基因突变的一致性Tab.3 The consistency of EGFR mutation in advanced lung adenocarcinoma by ARMS method and sequencing method 例（%）

本研究进一步提示临床上采用ARMS法进行小组织样本进行EGFR基因检测，可能进一步提高EGFR突变检测的检出率，但EGFR突变敏感性和精确度的提高是否有助于临床获益有待进一步分析。总体而言，肺腺癌小标本组织通过ARMS法和测序法进行EGFR基因突变检测具有一定的差异，参照测序法小组织样本EGFR基因结果需谨慎进行临床决策。