IL-28B rs12979860位点基因型检测在指导丙肝治疗中的应用价值

瞿 新

湖北医药学院附属人民医院 十堰市人民医院检验科，湖北 十堰 442000

丙型病毒性肝炎(hepatitis C virus, HCV)是慢性肝炎的重要类型，是目前全世界流行最为广泛的传染病之一，其引发的慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C, CHC)发病隐匿，易被患者忽视，是导致肝硬化、肝癌及肝功能衰竭的主要原因之一[1-2]。国际上治疗CHC的标准方案为聚乙二醇干扰素α(Peg-IFNα)联合利巴韦林(RBV)，近年来有研究[3]证明，CHC抗病毒治疗的临床疗效除了受病毒载量、年龄、种族、肝脏形态因素影响外，还与位于人体染色体19的编码干扰素λ3的白细胞介素-28B(IL-28B)单核苷酸多态性高度相关，但多数报道多集中于IL-28B rs8099917位点，且IL-28B对丙肝治疗疗效及预后的预测价值尚处于初步研究阶段。鉴于此，本文就十堰市人民医院2014年4月至2017年4月接受标准抗病毒治疗的85例CHC患者受体IL-28B rs12979860位点基因多态性检测进行分析，旨在进一步证实其对CHC治疗疗效及预后的预测价值。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2014年4月至2017年4月十堰市人民医院收治的85例CHC患者为研究对象，男53例，女32例，年龄(59.31±4.08)岁(21～68岁)，肝功能Child-Pugh分级为B级46例，C级39例；肥胖者15例(17.65%)，有职业性危害因素接触(包括苯、汽柴油、甲醛、氨基甲酸酯类、重金属、染发剂、杀虫剂、除草剂、化肥等)者28例(32.94%)，有病毒性肝炎史者16例(18.82%)，有家族肝炎史者12例(14.12%)。

1.2纳入及排除标准纳入标准：年龄≥18岁；影像学、生物化学或血液学、组织学检查结果及临床表现均符合中华医学会推荐的《病毒性肝炎防治方案》[4]中CHC诊断标准；对本研究目的和意义知情同意，并自愿参与。排除标准：预估生存时间<6个月；其他肝炎病毒及人类免疫缺陷病毒感染(如自身免疫性肝病、脂肪性肝病嗜肝病毒感染)；药物性或酒精性等因素所致肝功能异常、肝硬化；合并脑肺心肾等重要脏器功能障碍、其他严重系统疾病、血液和恶性肿瘤疾病；伴发食管胃底静脉曲张破裂出血、腹水及肝性脑病等严重并发症；对Peg-IFNα及RBV过敏或有使用禁忌证；妊娠或哺乳期妇女；临床病历及随访资料不全。

1.3治疗方法所有患者均根据《病毒性肝炎防治方案》[4]治疗标准实施标准化治疗方案，即Peg-IFNα联合RBV治疗。给予Peg-IFNα(美国先灵葆雅公司)180 μg腹部皮下注射，每周1次；按体质量给予RBV(浙江诚意药业有限公司)800～1 200 mg/d口服，治疗疗程为48周。

1.4疗效评估治疗结束时病毒学应答(ETVR):在治疗结束时，HCV RNA为阴性；持续病毒学应答(SVR)：治疗结束且停药24周随访时，HCV RNA为阴性；复发：治疗结束时HCV RNA<15 IU/ml，但停药后HCV RNA≥15 IU/ml(阳性)。

1.5受体IL-28B基因多态性测定采用双色荧光TaqMan分型技术检测IL-28B rs12979860位点基因型。主要试剂及仪器包括uctiSENS®easyMAG®system核酸自动提取仪、石蜡包埋组织基因组提取试剂盒(法国梅里埃公司)，PT-200 PCR仪(BIO-RAD)，DYY-8C电泳仪(北京六一仪器厂)。参照Genbank中SNP rs12979860基因序列，采用Vector NTI 11.0软件设计引物。针对基因型位点设计2对等位基因双色荧光PCR体系，构建特异性引物用于直接鉴别rs12979860基因型，上游引物(P1)序列为：5′-ATCTCTGGACGTGGATGGGTAC-3′；下游引物(P2)序列为：5′-AGCGCGGAGTGCAATCTA-3′。扩增程序为95 ℃ 5 min预变性，然后93 ℃ 10 s、61 ℃ 30 s重复40个循环，61 ℃时采集荧光。参照说明书提取基因组DNA，按10 μl模板+40 μl反应液构成PCR反应体系，实时荧光定量PCR仪上机检测。

1.6统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计数资料用例数/%表示，CHC患者治疗效果及预后分析进行χ2检验；Logistic回归统计分析模型分析IL-28B rs12979860位点基因多态性分布与治疗效果及预后的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1IL-28Brs12979860位点基因型检测结果85例CHC患者中，CC型68例(80.00%)，CT型16例(18.82%)，TT型1例(1.18%)，CC型检出率显著高于非CC型，差异有统计学意义(χ2=61.20，P<0.05)。

2.2IL-28Brs12979860位点基因型与治疗效果的关系CC型患者ETVR率为76.47%、SVR率为82.35%，均明显高于非CC型的41.18%、52.94%；复发率为10.29%，明显低于非CC型的35.29%，差异有统计学意义(χ2=7.98、6.54、6.56，P<0.05)(见表1)。

表1 IL-28B rs12979860位点基因型与治疗疗效的关系Tab 1 Relationship between IL-28B rs12979860 genotype and therapeutic efficacy 比例/%

2.3IL-28Brs12979860位点基因型与预后的关系所有患者均进行随访，截至2017年9月30日，随访时间(16.60±7.15)个月，以出现肝硬化、肝癌等为预后不良。CC型、非CC型患者预后不良者分别为4例(5.88%)、4例(23.53%)，差异有统计学意义(P<0.05)。单因素分析显示，预后不良者中，年龄>59岁、有职业性危害因素接触、肥胖、病毒性肝炎史及非CC型的患者占比显著高于预后良好者，差异有统计学意义(P<0.05)(见表2)。为排除混杂因素的干扰，以预后为因变量(0=预后良好，1=预后不良)，以相关因素为自变量，并赋值，进行多因素非条件Logistic回归分析。赋值如下：年龄<39岁=0，39～59岁=1，>59岁=2；性别男=0，女=1；有职业性危害因素接触=0，无=1；肥胖=0，否=1；有病毒性肝炎史=0，无=1；有家族肝炎史=0，无=1；IL-28B rs12979860位点基因型CC型=0，非CC型=1。多因素非条件Logistic回归分析显示，年龄、职业性危害因素接触、肥胖、病毒性肝炎史及IL-28B rs12979860位点基因型是影响患者预后的危险因素(P<0.05)(见表3)。

表2 影响CHC患者预后的单因素分析Tab 2 Single factor analysis on the prognosis of CHC patients 比例/%

表3 影响CHC患者预后的多因素非条件Logistic回归分析Tab 3 Non-conditional Logistic regression analysis with multiple factors on the prognosis of CHC patients

3 讨论

IL-28B即宿主19号染色体负责编码IL-28B，是2003年国际人类基因组组织新发现的IFN家族的一员[5]，随后2009年GE等[6]在《Nature》上发表了第1篇HCV感染相关的全基因组关联分析研究，进一步阐述了IFN-λ3型干扰素基因，认为该基因上游rs12979860位点的单核苷酸多态性与CHC治疗的应答紧密相关。国内的研究表明，HCV干扰素治疗SVR率为60%～90%，如刘佳等[7]的报道发现，CC型、CT型和TT型患者获得 SVR率分别为71.31%、48.57%、0，有显著性差异，认为CC型与SVR关系密切。目前已经明确IL-28B在人体内、外均具有免疫调节与抗病毒效能，并可促进IFN-α的产生，在感染HCV患者的肝脏活组织样本中能发现IL-28B mRNAs的存在[8]。周双男等[9]的分析认为，IL-28B的基因多态性与抗HCV疗效及病情进展有一定相关性，一般将不同的IL-28B相关的基因型称为保护性和非保护性基因型，对于rs12979860位点而言，CC型为保护性基因型，CT型或TT型(非CC型)为非保护性基因型，CC型(保护性基因型)患者可获得较好的干扰素抗病毒应答率。

本研究85例CHC患者中，CC型占80.00%，CT型占18.82%，TT型占1.18%，CC型检出率显著高于非CC型，与临床多数报道[10-11]的CC型、非CC型频率分布一致。同时，CC型患者ETVR率、SVR率均明显高于非CC型，复发率明显低于非CC型，CC型、非CC型患者预后不良者分别占5.88%、23.53%，差异显著。提示IL-28B rs12979860位点基因型与CHC标准方案治疗疗效及预后密切相关，与刘立明等[11]的报道相符。多因素非条件Logistic回归分析进一步证实，除了年龄、职业性危害因素接触、肥胖、病毒性肝炎史外，IL-28B rs12979860位点基因型是影响患者预后的危险因素。因此，我们认为，可根据IL-28B rs12979860位点基因型检测结果指导CHC的个体化治疗。目前，基于患者HCV RNA或IL-28B多态性个体化治疗逐渐成为CHC新的治疗方向。且目前临床已有初步研究，如郭凤霞等[13]认为，通过检测CHC IL-28B基因型和HCV基因型以指导临床抗病毒治疗，可达到对标准方案治疗疗效的预测。王黎锋等[14]的临床研究根据IL-28B rs12979860位点将患者分为优势组和非优势组，非优势型组中，应用普通IFN和Peg-IFNα治疗后RVR率分别为16.00%和41.40%，SVR率分别为28.00%和55.17%，差异显著，由此认为检测宿主IL-28B基因优势型患者初始治疗可选择普通IFN，而非优势型患者初始治疗建议选择Peg-IFNα。陈新月等[15]的研究通过在治疗前检测IL-28B基因型并进行治疗疗程和剂量的调整，绝大部分(91.0%)患者可获得EVR，而通过EVR分组对患者进行个体化治疗的疗效较为理想。因此，我们建议在IL-28B rs12979860位点基因型指导下实施个体化治疗方案，如可对标准方案中两种药物的剂量、治疗时间等进行适当调整。在实际临床中，有少数患者因多种原因不能完成标准治疗方案的标准剂量和疗程治疗，影响总体抗病毒疗效及预后，可能对本研究结果产生一定影响，因此，本研究相关结论仍需后期扩大样本量进一步论证。