猪源干扰素刺激基因PPBP荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

王飞飞，刘 珂，郇贝丽，魏建超，邵东华，李蓓蓓，邱亚峰，石元元，钱莺娟，马志永，JUNG Yong-Sam

（1.南京农业大学动物医学院 教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室，南京210095；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

促血小板碱性蛋白（pro-platelet basic protein，PPBP）基因又名CXCL7。PPBP基因是一种干扰素刺激基因，IFN-α刺激细胞之后能够上调PPBP基因的表达，并且在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染过程中PPBP的表达差异具有显著统计学意义，因此我们推测PPBP基因表达的蛋白或许参与了机体抑制PRRSV感染过程。目前对于PPBP的研究，大部分集中于人类肿瘤方面，PPBP抗病毒机制研究尚未见报道。SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法具有实时性、特异性、准确性、灵敏性的特点。本研究通过荧光定量PCR检测方法，建立标准曲线，用来检测PPBP基因表达情况。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 大肠杆菌DH5α、胶回收试剂盒、无内毒素大量提取试剂盒购买自天根生化科技（北京）有限公司；Q5聚合酶购自New England Biolabs公司；SYBR®GreenⅠ反转录酶、限制性核酸内切酶购自TaKaRa公司；T4连接酶购自Thermo Scientific公司；7500 Real-Time PCR System（Applied Biosystems）、紫外分光光度计、涡旋振荡仪、琼脂糖凝脂电泳、凝胶成像系统购自上海达迈生物科技有限公司。

1.2 引物 根据GenBank数据库中猪PPBP基因序列，利用Beacon Designer 7针对其保守区设计特异性引物 Sus scrofa PPBP 1r：5'-AAATTGAGG GAAGAATGG-3'、Sus scrofa PPBP 2r：5'-ATGTT ACTGGGATGAATG-3'。利用Primer Premier 5.0引物设计软件设计猪的PPBP扩增引物Sus scrofa PPBP 1a 5'-GTGAAGCTTATGAGCCTCAGACTTGGCGC CATCT-3'、Sus scrofa PPBP 2a：5'-TATGAATTCA GCAGCTGACCCACCATCTTCCATTA-3'，引物由Invitrogen公司合成并测序。

1.3 细胞和组织中总RNA的提取以及反转录 按照Trizol法提取PAM细胞中总RNA，以2 μL的RNA为模板进行反转录，体系（20 μL）包含：1 μL 随机引物、4 μL 5×反转录 buffer、2 μL DTT、1 μL dNTP mix（10 mmol/L）、1 μL的反转录酶（200 U/μL）、1 μL RNA RNase Inhibition（20 U/μL），以反转录的产物为模板。

1.4 阳性标准模板的建立 以Sus scrofa PPBP 1a和Sus scrofa PPBP 2a为上下游引物，通过PCR扩增、酶切、连接等过程构建重组质粒p3XFLAG-CMV-7.1-PPBP。PCR体系：cDNA 0.5 μL、上/下游引物各0.5 μL、dNTP 1 μL、5×buffer 5 μL 、Q5 0.3 μL、DEPC水 17.2 μL。PCR程序：98℃预变性30 s；98℃变性10 s，54℃退火30 s，72℃延伸20 s，总共35个循环；72℃再延伸10 min。扩增出的目的条带，与质粒P3XFLAG-CMV-7.1，分别进行HindⅢ、EcoRⅠ的双酶切，16℃过夜连接。构建好的重组质粒送去Invitrogen测序，测序结果经Blast比对，结果正确，即为重组质粒构建成功。

1.5 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

1.5.1 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR体系的建立及优化 以质粒标准品为模板，反应体系为20 μL，分别对引物、模板、SYBR Green Ⅰ mix最佳使用量以及反应条件进行优化并绘制熔解曲线。

1.5.2 标准曲线的建立 将猪的PPBP质粒做10倍系列稀释，稀释至0.9×100copies/μL，并以系列稀释的标准质粒为模板，进行实时荧光定量PCR。反应体系：2×SYBRR Green premix Ex Taq II 10 μL、上下游引物各0.4 μL（25 pmol/μL)、ROX Reference Dye（50×）0.4 μL、DEPC水6.8 μL。反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火及延伸31 s，扩增40个循环。以Ct值为横坐标，以起始模板浓度的度数为纵坐标，绘制标准曲线。

1.5.3 敏感性检测 将荧光定量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，以0.9×1010～0.9×100copies/μL阳性质粒为模板，进行普通PCR，验证敏感性。普通PCR体系（50 μL）：H2O 40.7 μL、dNTP 1 μL、10×buffer 5 μL、Taq酶0.3 μL、上/下游引物各0.5 μL、模板2 μL。反应条件：98℃预变性15 s；98℃变性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸 15 s，35个循环；72℃再延伸2 min。

1.5.4 重复性实验 使用3次不同批次的质粒标准品进行批内重复实验和批间重复实验。

2 结果

2.1 标准品的制备 将PCR扩增获得的猪PPBP基因与p3XFLAG-CMV-7.1相连，对构建的重组质粒进行酶切鉴定和测序，结果正确。

2.2 阳性质粒标准品的准备 将阳性质粒转化步骤，使用无内毒素大提试剂盒，最后通过紫外分光光度计检测出阳性质粒浓度为270 ng/μL。将浓度单位转化为copies/μL。通过公式（6.02×1023）×（质粒浓度ng/μL×109）/（质粒长度×660），计算得到浓度为0.9×1011copies/μL ，10倍系列稀释阳性质粒，梯度为0.9×1010~0.9×100copies/μL。

2.3 反应体系中各组分的优化以及反应条件的优化

2.3.1 反应体系中各组分的优化 分别在反应体系中加入不同浓度的引物和模板，检测结果的重复性和扩增效率，最后筛选出最佳反应体系（20 μL）：2×SYBR Green premix Ex Taq II 10 μL 、上下游引物各0.4 μL（25 pmol/μL)、ROX Reference Dye（50×）0.4 μL、DEPC水 6.8 μL。

2.3.2 反应体系中反应条件的优化 分别改变荧光定量PCR的变性、退火温度，最终得到最佳反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火31 s。

2.4 标准曲线绘制 上游引物：5'-AAATTGAGGGAAGAATGG-3'，下游引物：5'-ATGTTACTGGGATGAATG-3'。荧光定量体系（20 μL）：SYBR Green Ⅰ 10 μL、上/下游引物各0.4 μL、ROX 0.4 μL、DEPC水 6.8 μL。程序：98℃预变性30 s；98℃变性5 s，60℃退火31 s，40个循环。产生熔解曲线程序：98℃ 15 s，60℃30 s。以0.9×1010～0.9×100copies/μL为模板进行荧光定量PCR实验，结果显示标准曲线为y=-3.2624x+39.963，R2=0.9916（图1），扩增效率为102%，其中y是Ct值，x是拷贝数的对数值。

图1 实时荧光定量RT-PCR检测猪的PPBP的扩增曲线(A)和标准曲线(B)Fig.1 Amplif i cation curve(A) and standard curve(B) of real-time fl uorescent quantitative PCR

2.5 特异性与敏感性分析 产生的熔解曲线呈现单一峰值，扩增曲线呈现典型的S型曲线（图2）。检测结果显示，实时荧光定量PCR（图3）比普通PCR（图4）敏感1000倍，说明建立的荧光定量PCR具有较高的特异性和敏感性。

2.6 稳定性和重复性分析 将6个不同稀释度的标准品（0.9×109～ 0.9×104copies/μL）同批次重复8次，得到批内CV为0.3%～1.1%；将这6个梯度标准品分3次于不同时间点进行检测，得到批间变异系数CV为2.1%～4.7 %。结果表明该实验体系具有较好的稳定性和重复性（表1）。

图2 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测猪PPBP的熔解曲线Fig. 2 The dissociation curve of real-time SYBR GreenⅠf l uorescence quantitative PCR for porcine PPBP

图3 猪PPBP标准品实时荧光定量PCR检测结果Fig.3 Real-time PCR detection for porcine PPBP standardM: DNA 分子量标准(DL2000); 1~6: 初始模板浓度分别为0.9×109~0.9×104M: DNA Marker(DL2000); 1-6: Initial template number were 0.9×109-0.9×104, respectively

图4 猪PPBP标准品普通PCRFig.4 Regular PCR detection for porcine PPBP standardM: DNA 分子标准(DL2000); 0～10:0.9×100 ~0.9×1010 copies/μLM: DNA Marker(DL2000); 0-10: 0.9×100 –0.9×1010 copies/μL,respectively

2.7 临床应用 使用建立的荧光定量PCR方法，检测感染猪和正常猪肺脏、肝脏、肠系膜组织中PPBP的含量，结果见表2。结果表明不同组织之间，同种组织不同状态下，PPBP含量存在区别。

3 讨论

我国是一个农业大国，养殖业特别是养猪业的发展与我国经济发展密切相关。改革开放以来，我国养猪业保持着稳定持续的发展，已经成为畜牧业的支柱产业，对于农业经济发展、农业产业结构调整和农民收入的增加发挥着重要作用。然而，目前养猪业存在着大量的问题，其中猪病流行最为突出，每年都会造成巨大的经济损失，给我国养猪业带来严峻的挑战。

PPBP基因又名CXCL7，由此基因编码的蛋白称为促血小板碱性蛋白。在血栓形成中，由激活血小板释放，并且能够牵引中性粒细胞到达受伤位置发挥作用。CXCL7属于中性粒细胞激活细胞因子，N端有一个ELR基序，是CXCR2受体潜在的激活物。这个生长因子是一个有效的趋化物和激活物，可以刺激各种细胞过程，例如DNA合成、有丝分裂、糖酵解。另外PPBP表达蛋白是一个抗微生物蛋白，具有抗细菌和真菌活性。目前研究表明在人类吞噬细胞系中，PPBP可以抵抗结核分枝杆菌和嗜肺军团菌。人源PPBP有单体和二聚体两种形式。 PPBP基因由128个氨基酸编码，蛋白大小为14 kDa。PPBP有四种变异体，包括血小板基础蛋白（PBP）、连接组织激活肽Ⅲ（CTAP-Ⅲ）、血小板球蛋白（小板球）、中性粒细胞激活蛋白2（NAP-2）。本研究建立的PPBP SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的标准曲线斜率为-3.2624，扩增率为102 %，相关系数为0.9916。对三份不同批次的标准品分别进行3次批内重复和3次批间重复检测，变异系数均小于5%。结果表明初步建立的PPBP SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法灵敏度好、特异性强、重复性好，可以定性定量检测猪样品中PPBP的含量，为深入研究PPBP的功能和机制奠定了基础。

表1 标准曲线重复性检测Table1 Result of standard curve repeatability

表2 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法检测组织中PPBP的含量Table2 Detection results of PPBP in tissues by SYBR Green Ⅰreal-time fl uorescent quantitative RT-PCR