地黄活性成分梓醇在大鼠体内的代谢变化研究*

陈少云 周 静 李 敏 范红晶 张宇燕

（浙江中医药大学，浙江 杭州 310053）

地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的块根，始载于《神农本草经》，列为上品。鲜地黄具有清热生津、凉血、止血的功效，生地黄具有清热凉血、养阴生津的功效，其炮制品称为熟地黄，具有补血滋明、益精填髓的功效[1]。现代药理学及临床研究表明，地黄具有较好的增强免疫功能、止血、抗肿瘤、抗衰老、保护中枢神经系统、降血糖、保护胃签黏膜、降血脂、保肝等作用[2-10]。

地黄主要含有环烯醚萜苷类等物质，其中含量最高的环烯醚萜苷是梓醇[11]。而目前对地黄物质基础的研究也比较集中的是环烯醚萜类成分，主要以梓醇比较突出[12-13]。大量研究表明，梓醇在心脑血管系统、中枢神经系统、降血糖、调血脂、抗肿瘤、抗辐射、抗骨质疏松、抗炎、提高免疫等均有较强的药理活性[14-18]。梓醇的提取工艺研究也使其具备了大量生产的可能性[19-20]，同时也开展了梓醇在大鼠体内的相关药代动力学研究[21-22]，但关于梓醇的体内代谢途径和代谢产物尚不清楚，其发挥药效功能的作用机制也有待进一步深入。本实验采用HPLC-MS联用技术检测大鼠口服地黄水提液后体内梓醇的代谢变化，初步探讨梓醇在体内的可能代谢途径和变化规律，可为地黄及含有梓醇的药物的体内外代谢分析和进一步的药效结合研究提供参考。

1 材 料

1.1 实验动物 SPF清洁级SD雄性大鼠，体质量（200±20）g，购于浙江中医药大学动物实验中心（上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供），动物实验条件许可证：SCXK（浙）2013-0184。

1.2 试药与仪器 地黄采购于浙江中医药大学名中医馆，经鉴定为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的块根，批号：20170307；其余试剂和药品均为进口或国产分析纯。Agilent GC6890（安捷伦科技）；质谱Qtrap 4500 （AB SCIEX）；HWS26电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器）；HH-2数显恒温水浴锅 （常州国华电器）；DHG-9030A电热恒温鼓风干燥箱 （上海精宏实验设备）；3-18K高速冷冻离心机（美国Sigma-Aldrich）。

2 方法与结果

2.1 地黄水提液的制备 称取地黄50 g，充分粉碎，用10倍体积蒸馏水于45℃恒温水浴中浸提8 h后过滤，滤液浓缩至1 g/mL，作为地黄水提液。

2.2 血浆样品的制备 取8只SD大鼠，其中空白对照组2只，其余为实验组。禁食，自由饮水，12 h后对实验组的大鼠分别灌胃地黄水提液（15 mL/kg），于给药后 5、15、30、45、60、90、120、240、360、480 min 眼 眶取血0.3 mL，置于离心管中，在8000 r/min条件下离心10 min，取上层血浆置于离心管中，-20℃冷藏备用。1 h内各取样点尾静脉注射0.3 mL生理盐水，1 h后各取血点腹腔注射0.3 mL生理盐水以补充血容量。

2.3 HPLC-MS分析血浆中梓醇及潜在代谢物 取血浆0.2 mL加入20% 三氯乙酸水溶液20 μL沉淀蛋白，涡旋2 min，在 12000 r/min条件下离心 10 min，取上清液，0.45 μm水系微孔滤膜过滤，HPLC-MS进样分析。HPLC条件：色谱柱Zorbax C18柱，梯度洗脱，流动相A：水（含2 mmol/L乙酸铵和0.05%甲酸），流动相B：乙腈（含 0.05%甲酸），柱温 40℃，流速 0.7 mL/min。MS 条件：负离子模式，CUR 25，IS 5500，TEM 575，GS1 60，GS2 60，CAD Medium。对质谱图进行分析，并根据梓醇及代谢可能途径的碎片离子分析判断梓醇及潜在代谢物，结果见表1、图1、图2，结果表明，梓醇进入大鼠体内后，除其本身分子以外，发现了6个转化后的产物，分别是：异构体（Isomer）、甲基化物（M1， Methylation）、羟基化物（M2，Hydrogenation）、糖基化物（M3，Glucose）、 脱氧羟基化物 （M4，Hydrogenation+Loss of O）、脱氧羟基化甲基化物 （M5，Methylation+Hydrogenation+Loss of 2O），并推断其可能的结构。测定各个时间点的梓醇及潜在代谢物的浓度观察在大鼠体内的代谢变化过程，见图3，结果显示，梓醇及其多个代谢物在大鼠血液中的浓度均在灌胃后45 min达到最高，随后呈下降趋势，在240 h时基本代谢完成。

表1 梓醇潜在代谢物列表

图1 梓醇及其代谢物的质谱图

图2 梓醇及其可能代谢途径

图3 梓醇及其代谢物的代谢变化曲线

3 分析与讨论

梓醇是地黄的主要活性成分，具有较强的药理活性，也是地黄物质基础研究的重点，本实验采用HPLC-MS联用技术，根据梓醇的结构及碎片离子规律，分析鉴定出地黄水提液进入大鼠体内后，大鼠血浆中除了梓醇分子以外，还有1个异构体和5个转化产物：异构体、甲基化物、羟基化物、糖基化物、脱氧羟基化物和脱氧羟基化甲基化物，并推断其可能的结构，分析梓醇体内代谢途径。

从动态代谢过程曲线显示，梓醇及其代谢物在大鼠血液中的浓度均在灌胃后45 min达到最高，随后呈下降趋势，240 h后浓度降至最低。梓醇与其代谢物可同时存在于大鼠体内，协同发挥较强的药理活性，本研究可以为地黄及含有梓醇的药物的体内外代谢分析、与药效结合的药动学-药效学（PK-PD）研究及对深入梓醇的作用机理研究提供参考。