仙灵骨葆胶囊对大鼠骨质疏松性骨折愈合过程中骨形态发生蛋白2和血小板衍生生长因子表达的影响*

秦桂芳 李霞清

（湖北医药学院附属人民医院，湖北 十堰 442000）

骨质疏松症属全身性、代谢性骨骼系统多基因疾病，多发生于老年人，如绝经后妇女和老年男性性腺机能减退者，临床表现为骨量和骨密度进行性下降，因骨微结构破坏并由此导致骨强度下降及骨脆性增加，故骨质疏松症患者极易发生骨质疏松性骨折[1]。骨质疏松性骨折是骨质疏松症最严重并发症，是我国人口老龄化后的重要的公共健康问题[2]。临床上骨质疏松性骨折多指原发性骨质疏松症导致的骨折，属脆性骨折，骨折部位以髋部、肱骨近端、脊柱及桡尺骨远端常见[3]。临床治疗老年男性因性腺功能减退造成骨密度（BMD）下降者常采用睾酮肌内注射或口服十一酸睾酮进行激素代替疗法，但睾酮替代疗法可能造成肝肾功能受损并增加前列腺增生和前列腺癌的发生风险，故激素代替疗法有一定的局限性[4]。本实验选用雄性去势SD大鼠造模，可相对真实反映男性性腺机能减退导致骨质疏松性骨折的病理改变和病理进程，选用治疗骨质疏松症的中成药仙灵骨葆胶囊作为研究对象来进行实验研究，以期为临床治疗骨质疏松性骨折提供理论依据，对临床用药起到指导作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠共96只，雄性，体质量160～180 g，实验动物由湖北医药学院动物房提供（鄂 20170331）。

1.2 试药与仪器 SG-51正置型金相显微镜购自上海光学仪器厂；X射线骨密度仪购自天津圣鸿医疗器械有限公司；图像分析系统（美国Media Cybernetics公司）；仙灵骨葆胶囊（贵州同济堂制药有限公司，批号：C201710122124）；BMP-2、PDGF 和 TIMP-1 酶联免疫吸附试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）；D-半乳糖注射液购自北京索莱宝生物科技有限公司；水合氯醛购自扬州市奥鑫助剂厂。

1.3 造模及分组 96只中随机选取72只大鼠，先适应性喂养1周，参照孙岩[5]的研究方法，于去势手术的同时颈部皮下注射D-半乳糖（100 mg/kg）的方法建立大鼠骨质疏松模型。另取24只正常大鼠设为假手术组，不手术造模。手术前腹腔注射1%水合氯醛（0.5 mL/100 g）深度麻醉大鼠，然后固定于小动物手术台，用10%硫化钠脱去下腹部及阴囊处鼠毛并消毒，铺无菌巾，切开阴囊皮肤，分离精索并找到睾丸，结扎精索及血管后切除双侧睾丸，然后逐层缝合、消毒。然后按100 mg/kg剂量颈部皮下注射D-半乳糖。因本手术严格按无菌操作，故术后无需使用抗生素预防感染。8周后用X射线骨密度仪测量大鼠骨密度（BMD），筛选其中BMD较假手术组明显降低的大鼠再采用手术折断右侧股骨干中段制备骨质疏松性骨折模型，本实验在造模期间无动物死亡，所有动物经X射线骨密度仪筛选均合格（造模成功）。将成模的72只大鼠采用随机数字表编号，然后随机分为模型组、睾酮组和干预组，另取24只正常大鼠设为假手术组，不手术造模用以空白对照。

1.4 干预方法 干预组给予仙灵骨葆250 mg/（kg·d），每日2次灌胃；睾酮组给予十一酸睾酮2 mg/（kg·d），每日2次灌胃；假手术组和模型组予等量0.9%氯化钠注射液每日2次灌胃。以上各组均干预18周。

1.5 标本采集与检测 分别于治疗第5、9、18周取每组中的8只大鼠静脉血1 mL，采用酶联免疫吸附试验法测定大鼠静脉血PDGF。检测时取样品于室温放置2 h，1000×g 离心 20 min，取上清，取出酶标板，按照标准品的次序分别加入50 μL的标准品溶液于空白微孔中。空白微孔中加入50 μL的样品，空白对照加入100 μL的蒸馏水。在各孔中加入100 μL的酶标记溶液（不含空白对照孔）。将酶标板用封口胶密封后，37℃孵育反应1 h（在孵育箱中保持稳定的温度与湿度）。充分清洗酶标板5次，保持各孔有充足的水压（浓缩洗涤液以1∶100的比例与蒸馏水稀释。酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干。各孔加入显色剂A和显色剂B 50 μL，20～25℃下避光反应15 min。然后各孔加入50 μL终止液，终止反应。将酶标仪波长调至450nm读取样品OD，再以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。使用curve expert 1.3软件绘制标准曲线并读取样品浓度。PGI2、PGE2的酶联免疫吸附试验法参考以上步骤严格按测试盒说明进行实验。取血后处死动物，取骨痂和关节软骨组织采用免疫组织化学染色法分别检测大鼠，BMP-2及TIMP-1的表达，采用骨密度仪测量大鼠BMD。

1.6 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，组间比较采用独立样本的t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠BMD及BMP-2蛋白表达比较 见表1。假手术组第5、9、18周时BMD及BMP-2蛋白表达保持不变。模型组第5、9、18周BMD均较假手术组低（P＜0.05），但BMP-2表达虽有一定程度增强，但与假手术组比较差异不明显 （P＞0.05）。睾酮组第5、9、18周BMD均明显提高，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），十一酸睾酮对BMP-2表达无明显影响，与假手术组和模型组比较差异不明显（P＞0.05）。而干预组与模型组比较第18周时BMD明显提高（P＜0.05），但BMD提高程度无睾酮组明显（P＜0.05）；第9、18周BMP-2高表达，与假手术组、模型组和睾酮组比较差异明显（P＜0.05）。

表1 各组大鼠BMD及BMP-2蛋白表达比较（±s）

表1 各组大鼠BMD及BMP-2蛋白表达比较（±s）

与假手术组比较，*P＜0.05，与模型组比较，△P＜0.05；与睾酮组比较，▲P＜0.05。 下同

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2.2 各组大鼠PDGF及TIMP-1蛋白表达比较 见表2。假手术组第5、9、18周时PDGF及TIMP-1蛋白表达保持不变。模型组PDGF在第5、9、18周均保持较高水平，与假手术组比较差异明显（P＜0.05），但TIMP-1与假手术组比较差异不明显（P＞0.05）。睾酮组PDGF及TIMP-1蛋白表达变化规律与模型组相似，提示十一酸睾酮对PDGF及TIMP-1蛋白表达无明显影响，两者与假手术组和模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与假手术组、模型组和睾酮组比较，干预组第5、9周PDGF明显升高（P＜0.05），但到第18周时PDGF则降至假手术组水平，与模型组和睾酮组比较差异无统计学意义（P＜0.05）；第 9、18 周 TIMP-1 均高表达，与假手术组、模型组和睾酮组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组大鼠PDGF水平和TIMP-1蛋白表达比较（±s）

表2 各组大鼠PDGF水平和TIMP-1蛋白表达比较（±s）

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2.3 各组大鼠PGI2与PGE2含量的比较 见表3。模型组第5、9、18周PGI2和PGE2均保持较高水平，与假手术组比较差异明显 （P＜0.05）。睾酮组第5、9周PGI2和PGE2明显升高，与假手术组和模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），第 18周时PGI2和 PGE2则降至假手术组水平，与模型组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。而干预组PGI2和PGE2变化规律与睾酮组相似，在第5、9周PGI2和PGE2明显升高，与假手术组和模型组比较差异明显（P＜0.05），但两者升高程度无睾酮组明显，与睾酮组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；在第18周时PGI2和PGE2则均降至假手术组水平，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。但两者与睾酮组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠PGI2和PGE2含量比较（ng/L，±s）

表3 各组大鼠PGI2和PGE2含量比较（ng/L，±s）

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3 讨 论

仙灵骨葆胶囊是骨质疏松症及骨折等常用非处方药，收录于2009年《国家基本药物目录》，主要由淫羊藿、补骨脂、川续断、地黄等中药组成，具有滋补肝肾、强筋壮骨、活血通络之功效[6]。大量基础及临床医学研究表明，仙灵骨葆胶囊可提高骨质疏松症及骨质疏松性骨折后骨量、增加骨密度和骨强度，可显著改善骨质疏症及骨质疏松性骨折局部血流、调节组织钙磷代谢、促进钙沉积并抑制骨吸收，对加速软骨性骨痂向骨性骨痂的转化起到促进作用[7-8]。因其对骨质疏松症及骨质疏松性骨折等骨伤科疾病有显著的防治作用，常用于骨折、骨质疏松症、骨质疏松性骨折、骨无菌坏死及骨关节炎等的防治，是骨质疏松症及骨折的首选中药制剂[9]。

骨质疏松症患者激素水平改变及钙、磷代谢发生紊乱、成骨细胞活动减弱而骨吸收增强造成骨量逐步丢失，骨量、骨密度和骨强度降低，导致骨折的概率增大[10-11]。研究表明，在骨质疏松性骨折的愈合不同阶段，BMP-2和PDGF均起到重要的调节作用。PDGF在膜内成骨时可诱导间充质干细胞向成骨细胞分化及促进成骨细胞增殖的作用，还可以诱导受损血管内皮细胞和上皮细胞的分裂与增殖，促进损伤组织血管的形成与再生以加速创伤修复[12-13]。PDGF主要贮存在血小板α颗粒中，是一种碱性蛋白质，PDGF参与前列腺素代谢和磷酸酯酶激活过程，PDGF与有相应受体的细胞作用时能诱导磷酸酰肌醇循环，促进花生四烯酸释放和PGI2、PGE2的生成。研究表明，增加PGE2和PGI2可能加速骨吸收，并增加其抗血小板及扩血管以的活性，因此，在骨折的愈合不同阶段，PGE2和PGI2起到不同作用[14]。另外，PDGF还可通过上调TIMP-1抑制胶原酶达到抑制基质金属蛋白酶-10合成的目的，其含量与基质金属蛋白酶-10负相关，其机制可能是通过整合激素途径参与骨质疏松症骨代谢高转换过程并减少细胞外基质的降解而保护关节面和关节软骨[15-16]。BMP-2是最强的骨成长因子，能够刺激和诱导间充质细胞在骨组织形成区的分化和增生，刺激成骨细胞分化增殖，增强成骨细胞活性而增加骨量、加速骨重建以促进骨折愈合[17-18]。

本研究中，我们发现模型组BMD均较假手术组低，且PDGF、PGI2和PGE2在20周内均保持较高水平，而第5、9、18周BMP-2和TIMP-1表达均有一定程度增强。这一结果提示大鼠骨质疏松性骨折模型是成功的，这在本实验中有对照意义。造模使大鼠PDGF、PGI2和PGE2升高，前已述及，PDGF升高可诱导间充质干细胞向成骨细胞分化及促进成骨细胞增殖的作用，PGI2和PGE2升高有利于增加其抗血小板及扩血管以的活性，促进骨折区域组织修复，但PGE2和PGI2增加又有可能加速骨吸收，这又会降低骨量、加重骨质疏松，这也是模型组第5、9、18周BMD均较假手术组低的原因之一。观察发现，十一酸睾酮对BMP-2、PDGF及TIMP-1蛋白表达无明显影响，睾酮组第5、9、18 周 BMD 均明显提高，PGI2 和 PGE2 在第 5、9周明显升高，第18周时PGI2和PGE2则明显降低，说明十一酸睾酮仅对BMD、PGI2和PGE2有明显的影响。而干预组第18周时BMD明显提高，但BMD提高程度没有睾酮组明显；与假手术组、模型组和睾酮组比较，干预组PDGF在第5、9周明显升高，但PDGF在第18周时明显降低，BMP-2和TIMP-1在第9、18周均高表达；PGI2和PGE2在第5、9周明显升高，但两者升高程度无睾酮组明显，到第18周时两者则明显降低。这一结果提示仙灵骨葆胶囊在骨质疏松性骨折愈合不同阶段的作用不同，仙灵骨葆提高雄性去势骨质疏松性骨折大鼠BMD的作用与十一酸睾酮相似，但这一作用主要通过调节骨质疏松性骨折愈合不同阶段BMP-2、TIMP-1和 PDGF的表达与 PGI2和 PGE2合成来实现。从实验结果来看，仙灵骨葆在骨折初期（第5、9 周）可上调 PDGF、BMP-2 和 TIMP-1，作为骨成长因子，BMP-2增高可刺激和诱导间充质细胞在骨组织形成区的分化和增生，刺激成骨细胞分化增殖，增强成骨细胞活性而增加骨量、加速骨重建以促进骨折愈合[19-20]。 同时，在骨折初期（第 5、9 周），仙灵骨葆通过上调PDGF和TIMP-1的，一方面刺激PGI2和PGE2合成，增加其抗血小板及扩血管以的活性，另一方面通过上调TIMP-1抑制胶原酶来抑制抑制基质金属蛋白酶-10合成，减少骨吸收及细胞外基质的降解而达到保护关节功能的作用。但高含量的PGE2和PGI2可能加速骨吸收，故在骨折愈合后期（第18周）PDGF、PGI2和PGE2则降至假手术组水平，这说明仙灵骨葆胶囊参与了骨质疏松性骨折愈合不同阶段中各种因子间相互作用的复杂过程，这一过程还有待于进一步实验研究来揭示。