美洲大蠊成虫肠道菌群多样性分析

郝艳芹， 周闯， 晋家正， 沈咏梅， 张修月， 岳碧松*

(1. 四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都610065；2.药用美洲大蠊四川省重点实验室，成都610081)

宿主肠道中微生物群落与其健康相关，它们能够与宿主相互协作增加机体整体适应性(张振宇等，2017)。肠道菌群能合成胆汁酸、胆碱以及短链脂肪酸等对机体健康有利的代谢产物(Nicholson & Wilson，2003)，微生物还能与宿主代谢互作产生维持宿主正常免疫的代谢产物，如小肽、多胺和甲基供体等(Nicholsonetal.，2012)。

美洲大蠊Periplanetaamericana隶属于蜚蠊目Blattaria蜚蠊科Blattidae大蠊属Periplaneta，杂食特性和超强的环境适应能力使其成为研究宿主与肠道菌群间协同进化关系的重要模型之一(Mullins，2015)。Ondrejech(2016)以美洲大蠊为模型研究肠道菌群与宿主关系时发现，使用抗生素消除肠道菌群后，宿主的代谢速率减缓且体质量降低，表明肠道菌群可能为宿主提供必要的营养物质。Sabree等(2009)在构建美洲大蠊的内共生菌——蟑螂杆状体属Blattabacterium的消化通路时，发现内共生菌能为宿主提供自身不能合成的氨基酸和维生素等，以提高宿主对营养不均衡食物的利用率。美洲大蠊肠道菌群具有高度多样性的特征，刘晓飞等(2015)采用体外培养从美洲大蠊成虫肠道中分离出20种细菌，它们多数属于变形杆菌门Proteobacteria和拟杆菌门Bacteroidetes这两大类昆虫肠道优势菌门。Bagde等(2013)在研究美洲大蠊成虫肠道时发现，可培养细菌不仅有芽孢杆菌属Bacillus，还有肠杆菌属Enterobacteria、志贺氏杆菌Shigasbasillus等机会致病菌，还有伤寒沙门氏菌Salmonellatyphi等致病菌。这些研究多集中在肠道菌群功能及它们是否能体外培养等方面，对美洲大蠊成虫肠道菌群结构的研究较为缺乏。本研究采用16S rRNA高通量测序技术研究美洲大蠊成虫肠道菌群多样性，避免遗漏体外不能分离培养的细菌，以期鉴定出更全面的美洲大蠊肠道菌群群落，深入研究肠道菌群与宿主相互关系。

1 实验方法

1.1 实验材料

实验采用的美洲大蠊成虫来源于四川好医生攀西药业有限责任公司美洲大蠊养殖基地。随机选取6只成虫，饥饿24 h，在无菌室用75%乙醇表面消毒30 s，再用无菌水漂洗3次。剪去虫体的翅膀和腿，用大头针固定头部，从背面中部的肛门开始剪开，直到头部。将整个肠道移到2 mL EP管中，-80 ℃保存(Carrascoetal.，2014)。

1.2 总DNA提取和PCR扩增及测序

混合6个肠道样品后用液氮研磨。参考十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取总DNA(李钧敏，金则新，2006)。琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，无菌水稀释样品至1 ng·μL-1。使用16S rRNA V4可变区的通用引物：515F(GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)、806R(GGACTACNNGGGTATCTAAT)进行PCR扩增，20 μL体系包括：High-Fidelity PCR Master Mix 10 μL，带Barcode的特异引物各1 μL，高保真酶0.3 μL，模板DNA 1 μL，剩余部分由ddH2O补齐，反应程序为：98 ℃ 1 min；30个循环(98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)；72 ℃ 5 min。产物送北京诺禾致源科技有限公司用HiSeq PE250平台测序。

1.3 数据分析

参照Qiime(V1.7.0，http：//qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)的Tags质量控制流程对获得的测序数据进行拼接和过滤处理。将处理后的数据以97%的一致性利用Uparse(Edgar，2013)全部聚类成操作分类单元(OTUs)。同时选取OTUs的代表性序列，使用Mothur(Wangetal.，2007)与SILVA的SSUrRNA数据库(Quastetal.，2013)进行物种注释分析并统计各样本的菌群组成。

2 结果

2.1 肠道菌群门水平上的多样性

通过16S rRNA测序检测到细菌序列67 492条，归类为581个OTUs，物种注释到21个门。肠道的优势菌门为厚壁菌门Firmicutes(56.96%)和拟杆菌门(33.13%)，其后依次为变形杆菌门(6.65%)、放线菌门Actinobacteria(1.11%)和浮霉菌门Planctomycetes(1.03%)等(表1)。

2.2 肠道菌群目水平上的多样性

从目水平上对美洲大蠊成虫肠道菌群组成进行分析发现，相对丰度≥0.1%的目占总目数的18.99%(15/79)。优势菌目主要为拟杆菌目Bacteroidales(32.11%)、芽孢杆菌目Bacillales(29.89%)、梭菌目Clostridiales(12.93%)和乳杆菌目Lactobacillales(10.73%)(表2)。

2.3 肠道菌群属水平上的多样性

对样品检测到的所有OTUs序列进行聚类注释后得到193个属，其中相对丰度≥0.1%的菌属有39个。除变形杆菌门的脱硫弧菌属Desulfovibrio(0.94%)等6个属、放线菌门的微球菌属Micrococcus(1.00%)和软壁菌门Tenericutes的无胆甾原体属Acholeplasma(0.18%)外，其余31属均属于厚壁菌门和拟杆菌门这两大优势菌门。厚壁菌门中的优势菌属分别为葡萄球菌属Staphylococcus(16.59%)、芽孢杆菌属Bacillus(13.26%)和Lactobacillus(8.92%)；拟杆菌门中的优势菌属为副杆菌属Parabacteroides(10.26%)(表3)。

表1 美洲大蠊肠道菌群门类组成Table 1 The intestinal microbiota composition of Periplaneta americana on phylum category

注： 相对丰度=物种有效序列数/样本总有效序列数； 下同

Note： Relative abundance=number of valid sequences of the species/ number of total valid sequencesl； the same below

表2 美洲大蠊肠道菌群目水平相对丰度(≥0.1%)Table 2 The intestinal microbial abundance of Periplaneta americana (≥0.1%)on order category

表3 美洲大蠊肠道菌群属水平相对丰度(≥0.1%)Table 3 The intestinal microbial abundance of Periplaneta americana (≥0.1%)on genus category

2.4 美洲大蠊肠道优势菌属中的菌种多样性

在美洲大蠊成虫肠道菌群中，共注释到83种细菌，但由于测序片段较短，数据并不可信。统计美洲大蠊排名前5的优势菌属中注释到的菌种，葡萄球菌属中注释到的松鼠葡萄球菌Staphylococcussciuri(14.95%)是美洲大蠊成虫肠道中的优势菌种。副杆菌属中注释到的菌种为Parabacteroidesmerdae。Lactobacillus中注释到的菌种为加氏乳杆菌L.gasseri、戊糖乳杆菌L.pentosus、粘膜乳杆菌L.mucosae和动物乳杆菌L.animalis(表4)。

表4 美洲大蠊肠道优势菌属中的菌种统计Table 4 Statistical analysis of species in the dominant genus of the Periplaneta americana intestinal microbiota

3 讨论

美洲大蠊成虫肠道菌群与其他昆虫具有一定的相似性，以厚壁菌门、拟杆菌门为主要优势类群(Sabree & Moran，2014；Douglas，2015)，这2个菌门中的许多种类能够消化纤维素、碳水化合物和蛋白质等。例如，厚壁菌门的优势菌属芽孢杆菌属和Lactobacillus为发酵类细菌，它们不仅能够利用碳水化合物生成乳酸，促进营养物质的吸收，还可以产生细菌素等物质抵抗真菌的侵害(Inglinetal.，2015)；拟杆菌门类杆菌属Bacteroides的大部分细菌拥有水解多糖的酶，能够把复杂的多糖转变成简单的可供宿主利用的营养物质(Xuetal.，2007)。除此之外，有研究发现变形杆菌门的优势菌属脱硫弧菌属是存在于人体肠道内常见的条件致病菌，它们在无氧条件下可将硫酸盐还原为对肠道上皮细胞具有毒性作用的硫化物，还可诱导上皮细胞的异常增殖，造成非炎症性肠病等(Loubinouxetal.，2002)，而其在美洲大蠊肠道中的作用有待进一步研究。放线菌门的许多种类能够参与宿主的碳氮循环和抵抗病菌侵染(Flint，2011；张晓杰等，2016)。这些主要优势菌门和其他一些菌属的存在为美洲大蠊的生长、发育和繁殖提供了有利的保障。

Bertino-Grimaldi等(2013)对美洲大蠊成虫肠道菌群研究时发现，其优势菌门为拟杆菌门和变形杆菌门，这与本研究结果差异较大。这种差异的产生可能与美洲大蠊的来源有关，本研究检测的是人工饲养种群，而Bertino-Grimaldi等(2013)检测的是野生种群。研究表明，美洲大蠊肠道微生物能够随着宿主饮食的改变而改变，当它取食高纤维食料时，厚壁菌门显著增加(Danielleetal.，2013)，取食高蛋白食料时肠道菌群的丰富性增加(Pérezcobasetal.，2015)。本实验所采用的样本为人工饲养种群，其生存条件和摄取的营养物质与生活在环境较为恶劣的下水道等地的野生种群有很大差异，所以与其他研究结果中优势菌门不一致是合理的。由于16S rRNA高通量测序片段较短，许多序列并不能注释到种，注释到种的结果可信度也不高。因此，只对排名前5的优势菌属中注释到的细菌进行了统计。结果发现，优势菌种为葡萄球菌属的松鼠葡萄球菌，它是一种常见的动物病原菌，不但能引起黄鳝Monopterusalbus、黄喉拟水龟Mauremysmutica等动物感染，还能引起人脑膜炎、尿路等感染(段荟芹，王利，2015)，但它是否会引起人工饲养的美洲大蠊患病尚无研究。Lactobacillus中的戊糖乳杆菌在人类肠道中占优势，能够帮助宿主降解肉类食物，同时还能够通过产生过氧化氢来帮助宿主抵抗致病菌的侵染(Tailliez，2004)。据此推测，它可能为美洲大蠊肠道中的益生菌，但其具体功能有待进一步研究。

本研究发现，美洲大蠊肠道菌群种类丰富，这可能与美洲大蠊适应性强、生存力强、食性杂有关。本研究为美洲大蠊与其肠道菌群之间的关系研究提供一定的理论参考，也为美洲大蠊的健康养殖提供了新思路。