秦岭滑蜥视网膜年龄相关的显微结构特征和胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学定位

高燕燕， 李琳， 赵禹， 朱妞， 杨纯

(山西师范大学生命科学学院，山西临汾041004)

蜥蜴亚目Sauria视网膜结构和机能与各自的生活习性一致(张育辉，贾林芝，2003)，且具有特殊的视觉再生能力(Langetal.，2002)。视网膜结构的增龄改变必然影响机体的视觉功能(孙庆艳等，2004)。胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)在星形胶质细胞中的表达可反映其功能活动状态(Biginietal.，2001；Williams，2017)。视网膜Müller细胞中表达GFAP是成体脊椎动物的共同特征(Sassoèetal.，1992)。GFAP在无蹼壁虎Gekkoswinhonis视网膜中的分布特点及年龄相关性变化，提示Müller细胞可能通过增强或减弱GFAP表达参与视网膜衰老过程中的生理功能调节(王智超等，2008)。

秦岭滑蜥Scincellatsinlingensis是我国特有的卵胎生蜥蜴(赵尔宓，1999)，为《国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的野生动物名录》收录物种(王志宝，2000)，相关研究局限于其部分器官系统的组织形态学(谢权等，2012；王丽敏等，2015，2016；Yang & Wang，2016；Yangetal.，2017)，尚无视网膜显微结构增龄性变化的相关报道。因此，对秦岭滑蜥幼体、亚成体和成体视网膜结构以及GFAP阳性表达变化进行探究，旨在积累蜥蜴类爬行动物视觉器官发育的基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

秦岭滑蜥采自山西省霍州市太岳山七里峪林区(110°40′～112°21′E，36°21′～36°45′N)，雌雄兼有。根据吻肛长(SVL)分为幼体组(SVL<48.08 mm)、亚成体组(48.08 mm≤SVL≤57.08 mm)、成体组(SVL>57.08 mm)(马小梅，计翔，2001；王丽敏，2016)，每组6只。实验动物经乙醚麻醉致死后，剥离眼球，置于不同固定液中。

1.2 常规组织化学染色

材料经Bouin’s液固定后，梯度乙醇脱水，透明，石蜡包埋，8 μm连续切片，苏木精-伊红染色。

1.3 免疫组织化学染色

材料经4%多聚甲醛固定过夜后，放入蔗糖溶液中梯度脱水，OCT包埋剂包埋，连续冰冻切片，切片厚度20 μm，-20 ℃保存，用于GFAP免疫组织化学染色。反应流程依次为：4%多聚甲醛后固定30 min；磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗(0.1 mol·L-1，pH7.2～7.6)，5 min×3次；3%H2O2室温下避光20 min；PBS浸洗，5 min×3次；5%BSA封闭液，室温孵育30 min；滴加一抗：Rabbit anti-GFAP(1∶200，博士德)，4 ℃孵育过夜；PBS浸洗，5 min×3次；滴加二抗：生物素标记羊抗兔IgG(博士德)，37 ℃孵育4 h；PBS浸洗，5 min×3次；滴加SABC(博士德)，37 ℃孵育30 min；PBS浸洗，5 min×3次；二氨基联苯胺(DAB)显色；水溶性封片剂封片。阴性对照实验采用PBS代替一抗，其余步骤同上。

1.4 观察与统计分析

切片于Olympus BX-51光学显微镜成像系统下进行观察，拍照。每张切片随机选取8个视野测量视网膜总厚度及各层厚度(单位：mm)。利用ImageJ随机选取10个视野(40×10)，测定各组视网膜GFAP免疫阳性细胞的平均灰度值。灰度分为0～256级，值越小，免疫阳性反应越强。采用SPSS 17.0中的Kolmogorov-Smirnov检验所得实验数据符合正态分布后，再进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)。实验结果以平均值±标准误表示，显著性水平设置为α=0.01(杨纯，张育辉，2003)。

2 结果

2.1 秦岭滑蜥视网膜显微结构

光学显微镜下可见秦岭滑蜥视网膜从内到外共分为10层：内界膜、神经纤维层、神经节细胞层、内网状层、内核层、外网状层、外核层、外界膜、视杆视锥层、色素上皮层(图版Ⅰ：1～3)。内界膜为无细胞结构的单层薄膜；神经纤维层从视网膜的四周伸向中央视盘，中间厚、边缘薄；神经节细胞层分布密度不均，从中央到边缘由稠密逐渐稀疏，胞核较大，核仁明显；内网状层最厚，由双极细胞的轴突、无长突细胞的树突和节细胞的树突组成；内核层3～5层，胞核圆，分布有双极细胞、水平细胞、无长突细胞、网间细胞和Müller细胞等；外网状层主要是内核层的纤维末梢与内核层的水平细胞、双极细胞的神经突起接合的地方，也含有Müller细胞的纤维侧枝；外核层由2层感光细胞核组成，核周质较少，2层细胞核交错排列，靠近外界膜一层的核较大，卵圆形，为视锥细胞核，靠近外网状层一层的核较小，圆形，为视杆细胞核；外界膜由Müller细胞的外突以及视杆细胞和视锥细胞的连接复合体形成；视杆视椎层由视杆细胞和视锥细胞的内、外节组成；色素上皮层位于视网膜最外侧，细胞呈柱形，胞核偏于外侧，胞质内密布黑色素颗粒，大量含有色素颗粒的突起向内延伸至紧邻的视杆视锥层的外节处，与脉络膜交界。

2.2 不同年龄组视网膜各层厚度和胞核数的比较

不同年龄组秦岭滑蜥视网膜的10层结构均清晰易辨(图版Ⅰ：1～3)。单因素方差分析结果显示，亚成体和成体视网膜总厚度较幼体明显增加(P<0.01)，但三者之间的神经节细胞层、外界膜以及视杆视锥层厚度无明显差异。从幼体经亚成体到成体，神经纤维层、内网状层、内核层、外网状层、外界膜逐渐增厚，而内界膜、神经节细胞层、外核层、色素上皮层、视杆视锥层先增厚再变薄。与幼体相比，亚成体视网膜中内界膜和外核层厚度显著增加，其他无明显差异；成体视网膜中神经纤维层、内网状层、内核层、外网状层、外核层和色素上皮层厚度显著增加(表1)。

表1 不同年龄组秦岭滑蜥视网膜各层厚度比较Table 1 The thickness of the retinal layers of Scincella tsinlingensis at different ages

注： 同行数据中， 标有完全不同的小写字母表示差异有统计学意义(P<0.01)

Note： In the same column， difference is significant with the completely different lowercase letters (P<0.01)

秦岭滑蜥个体发育过程中，视网膜细胞核层数变化不大。外核层和神经节细胞层细胞核层数相当，内核层细胞核数目较多(表2)。

表2 不同年龄组秦岭滑蜥视网膜细胞核层数Table 2 Layer number of nucleus in the retina of Scincella tsinlingensis at different ages

2.3 不同阶段视网膜GFAP阳性表达变化

不同年龄组视网膜GFAP免疫阳性主要定位于内界膜和神经纤维层，且以神经纤维层阳性最强。GFAP阳性表达呈现成体最强、幼体较强、亚成体最弱的年龄相关性(表3)。在亚成体阶段，可观察到视杆视锥层有少量GFAP阳性表达，视网膜其余各层均未见GFAP阳性表达(图版Ⅰ：4～9)。

表3 不同年龄组秦岭滑蜥视网膜胶质纤维酸性蛋白表达灰度值比较Table 3 Comparison of the gray levels of retinal glial fibrillary acidic protein expression of Scincella tsinlingensis at different ages

注Note：*P<0.01

图版Ⅰ 不同年龄组秦岭滑蜥视网膜结构及胶质纤维酸性蛋白的阳性表达
PlateⅠ Microstructure and immunohistochemical localization of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in the retina ofScincellatsinlingensisat different ages

1～3. 秦岭滑蜥视网膜各层结构(1. 幼体， 2. 亚成体， 3. 成体)， 4～9. 秦岭滑蜥视网膜GFAP免疫组织化学定位， GFAP阳性细胞呈棕黄色(4、 7. 幼体， 5、 8. 亚成体， 6、 9. 成体)； RPE. 色素上皮层， RCL. 视杆视锥层， OLM. 外界膜， ONL. 外核层， OPL. 外网状层， INL. 内核层， IPL. 内网状层， GCL. 神经节细胞层， NFL. 神经纤维层， ILM. 内界膜

1-3. the microstructure of the retinal layers (1. juvenile， 2. subadult， 3. adult)， 4-9. immunohistochemical localization of GFAP in the retina， GFAP positive cells are brown (4， 7. juvenile， 5， 8. subadult， 6， 9. adult)； RPE. retinal pigment epithelium， RCL. layer of rods and cones， OLM. outer limiting membrane， ONL. outer nuclear layer， OPL. outer plexiform layer， INL. inner nuclear layer， IPL. inner plexiform layer， GCL. ganglion cells layer， NFL. nerve filament layer， ILM. inner limiting membrane

3 讨论

秦岭滑蜥的视网膜结构与大多数脊椎动物相似，从内到外共分为10层。昼行性动物和夜行性动物视网膜的主要差异之一是感光细胞和神经节细胞的数目之比不同。前者视网膜、外核层和神经节细胞层的细胞数目相当，且细胞核层数较少，内核层细胞核数目较多，而后者视网膜外核层的细胞数目远多于神经节细胞层(鲍义恒，陈云俊，1979；王厚华等，1980；张育辉，刘家坤，1994；张育辉，贾林芝，2003)。秦岭滑蜥视网膜的外核层和神经节细胞层细胞数目之比均相当，细胞核层数上，外核层1～2层，神经节细胞层3～4层，而内核层6～8层，符合昼行性动物视网膜的特征，故推测秦岭滑蜥为昼行性动物。

秦岭滑蜥、铜蜥Lygosomaindicum、北草蜥Takydromusseptentrionalis及丽斑麻蜥Eremiasargus均为昼行性动物，捕食主要依赖视觉，视网膜总厚度相近，各层厚度也较接近，其中，视杆视锥层和外核层细胞核层数均较少，相对较薄，且以视锥细胞的锥部为主，视锥细胞比视杆细胞粗短，细胞核较少但直径较大；它们与夜行性或晨昏性活动的无蹼壁虎、耳疣壁虎Gekkoauriverrucosus视网膜总厚度相差较大，后者的视杆视锥层和外核层细胞核层数均较多，相对较厚，以视杆细胞为主，且比视锥细胞细长而密集，细胞核较多但直径较小，这有助于增加吸收光线的面积，从而提高光敏度，有利于夜间活动(张育辉，贾林芝，2003)。秦岭滑蜥亚成体和成体视网膜总厚度较幼体明显增加，但三者神经节细胞层、外界膜以及视杆视锥层厚度之间无明显差异。幼体视杆视锥层较薄，其中视杆细胞较多而视锥细胞较少，与其活动性较弱相适应。亚成体活动性逐渐增强，视网膜的视杆视锥层亦增厚，利于白天活动。成体视杆视锥层最薄，视杆视锥层结构改变，主要由视锥细胞较为粗短的锥部组成。与幼体相比，亚成体和成体视网膜总厚度增加极显著，亚成体视网膜中内界膜和外核层厚度显著增加，成体视网膜中神经纤维层、内网状层、内核层、外网状层、外核层和色素上皮层厚度显著增加。上述结果表明，秦岭滑蜥视网膜各层厚度与年龄呈相关性，反映其视觉功能的发育特点。

GFAP是胶质细胞特有的一种中间丝蛋白，用于标记分化的胶质细胞(Sueishietal.，1996；孙庆艳等，2004)，参与细胞支架重组、髓鞘形成、细胞黏附和信号转导等复杂过程(Biginietal.，2001；薛黎萍等，2010；邓海波等，2012)。GFAP主要在秦岭滑蜥视网膜神经纤维层的Müller细胞中分布，与Sassoè等(1992)的报道一致：Müller细胞内侧端的胞体、突起和膨大的终足是GFAP阳性颗粒分布的主要区域。GFAP阳性表达呈现幼体较强，亚成体最弱，而成体最强的年龄相关性。秦岭滑蜥幼体阶段视网膜Müller细胞表达GFAP较强，这可能是由于Müller细胞胶质化增生在视网膜早期阶段具有修复作用(邓海波等，2012)。Müller细胞中GFAP表达变化类似星形胶质细胞损伤后的反应，星形胶质细胞GFAP表达增加表现为反应性星形胶质化，且GFAP在其细胞内的分布对于星形胶质细胞突起的形成和结构稳定至关重要(柯技等，2007)。Müller细胞与吞噬细胞相似，能够清除神经元变性坏死产生的碎片及代谢产物，避免这些物质对周围存活神经元产生毒性作用，并且活化的Müller细胞能够合成和分泌多种细胞因子，如神经生长因子(NGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、细胞粘连分子(跨膜糖蛋白CIM)、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白及其他细胞外基质组成成分(Hottaetal.，1995)，对维持神经元的生存、发育、再生和分化有重要作用(Schellinietal.，1995)。据此推测Müller细胞能够维持秦岭滑蜥视网膜稳定，对视神经增殖和生长发育也有一定的影响，为再生视网膜神经细胞提供丰富的黏着基质，从而起支持作用(Romero-Alemánetal.，2004；王智超等，2008)。

综上所述，秦岭滑蜥视网膜结构与其生活习性相适应，GFAP阳性表达的年龄相关性变化反应其视觉功能的发育特点，并可能与视网膜的生理功能调节相关。