应用DNA条形码技术鉴别寄生紫薇绒蚧的跳小蜂

张泽源， 秦耀光， 李枢强*

(1. 中国人民大学附属中学分校，北京100080；2. 中国科学院动物进化与系统学重点实验室，中国科学院动物研究所，北京100101)

紫薇绒蚧Acanthococcus(=Eriococcus)lagerstroemiae隶属于半翅目Hemeptera毡蚧科Eriococcidae，常被称为紫薇绒粉蚧、石榴毡蚧、石榴绒粉蚧，在我国分布广泛(赵洋民等，1997；姜年俊，许惠，1998；贺冬英等，2008；赵文娟等，2016)，国外分布于韩国、日本等，是危害石榴PunicagranatumL.和紫薇LagerstroemiaindicaL.的主要害虫(张钦书，孟庆喜，1990；马金华，2011)。2004年紫薇绒蚧首次在北美被发现，目前在美国12个州有分布(Merchantetal.，2014；Wangetal.，2016)，被认为是危害紫薇的重要入侵生物(Wangetal.，2016)。随着农药应用比重减小，利用寄生蜂防治紫薇绒蚧变得日益重要。

姜年俊和许惠(1998)、焦浩和张玉俊(2011)在紫薇绒蚧防治研究中提到了寄生蜂的作用，但未明确具体的种类。根据徐志宏和黄建(2004)的记载，寄生紫薇绒蚧的跳小蜂有4种：绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus(=Aphycus)eriococci、绵蚧阔柄跳小蜂Metaphycuspulvinariae、绒蚧亚翅跳小蜂Submicroteryseriococci和食绒蚧亚翅跳小蜂Submicroteryseriococcophagus，但是否均寄生紫薇绒蚧需进一步核实。准确鉴定寄生紫薇绒蚧的跳小蜂物种是研究其生物学特性及保护与利用的前提和基础。但跳小蜂种类多、个体微小(通常为1～2 mm)，利用形态特征鉴定时常常需要制作玻片标本并在显微镜下观察分类特征。另外，隐存种现象在昆虫中非常普遍(Bickfordetal.，2007)，营寄生生活昆虫的该现象可能更加突出(Smithetal.，2008)，这导致仅依靠形态特征对跳小蜂进行种类鉴定变得愈加困难，而且容易产生误差。DNA条形码技术作为一种辅助物种鉴定的工具(Hebertetal.，2003)，近年来得到了广泛应用，在昆虫鉴定方面应用前景广阔(肖金花等，2004；张合彩，乔格侠，2008；宋南等，2013)。近几年，该技术在寄生蜂鉴定中同样表现出很高的应用价值(Zhou MJetal.，2012；Zhou QSetal.，2014)，不但解决了一些近缘种、隐存种等分类学难题，同时也对阐明寄生蜂对寄主的专化性起到了重要作用(Zhangetal.，2011；Chestersetal.，2012；Zhouetal.，2018)。

本研究首先对寄生紫薇绒蚧的跳小蜂种类做了野外调查，获取了北京、山东、江苏、江西、湖北、湖南、云南、黑龙江、内蒙古、广西、宁夏、四川、山西和海南的跳小蜂样本。针对跳小蜂体型小、外部形态变异程度难以把握等分类中的难题，采用分子生物学方法，利用线粒体COⅠ基因的特异性片段(DNA条形码)来区分和识别寄生紫薇绒蚧的几种跳小蜂，为今后紫薇绒蚧寄生蜂的快速鉴定和深入系统研究提供有效数据参考。

1 材料和方法

1.1 样本的采集、保存和鉴定

本研究中的寄生蜂，除特别指出，均是育自紫薇绒蚧的若虫或雌成虫，紫薇绒蚧的采集和饲养方法参考Zhang等(2011)。野外采集带有紫薇绒蚧的老龄若虫或成虫的植物枝条并尽快带回实验室观察。在室内将带有紫薇绒蚧若虫或成虫的枝条剪短，放在塑料杯或者尼龙袋中饲养；每天观察出蜂情况，发现有羽化的寄生蜂即用毛刷将其收集于塑料管中，用无水乙醇浸泡杀死，-4 ℃存放。在体视镜下检视收集到的标本，参考文献(徐志宏，黄建，2004；Zhang & Huang，2004；Wangetal.，2014)进行初步形态分类并通过专家的复核。每个形态种选取一定的样本用于分子研究，并对所选样本拍照，便于后期进一步核对。材料样本信息见表1。

1.2 基因组总DNA的提取

先用蒸馏水冲洗选取的跳小蜂虫体，放于滤纸上，晾干后使用试剂盒(Qiagene Tissue DNA Kit)提取各样品的DNA，过程严格按照试剂盒说明书操作。凝胶电泳检测DNA质量。将合格的DNA样品放入4 ℃备用，或-20 ℃长期保存。

1.3 PCR扩增

目的线粒体COⅠ基因片段扩增选用的引物对参考Zhang等(2011)。PCR扩增的反应体系：5 μL 10×buffer PCR缓冲液，25 mM MgCl2，5 mM dNTP混合液，0.5 U TaqDNA聚合酶，正反向引物各10 pmol和5 μL DNA模板。PCR扩增反应程序为：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收后的产物送测序公司用ABI3730测序仪双向测序。

1.4 数据处理

获得的线粒体COⅠ基因片段与GenBank下载的COⅠ基因序列经Clustal W(Thompsonetal.，1994)比对后用BioEdit 7.0.5(Hall，1999)进一步编辑，使用MEGA4(Tamuraetal.，2007)分析各序列的碱基组成、保守位点、变异位点、转换与颠换的比值(R)等。选取刷盾跳小蜂Encyrtussp.为外群，采用邻接法(NJ法)构建基因树(K2P模型)，并计算种间和种内遗传距离。另外使用BarcodingR(Zhangetal.，2017)对寄生紫薇绒蚧的跳小蜂以及阔柄跳小蜂属Metaphycus属内种间和种内遗传距离的间隔进行分析评估。

表1 跳小蜂样品采集信息Table 1 Sampling information of encyrtids

续表1编号Code形态种名Species地点Locality时间Collecting date寄主植物Host plantGenBank登录号GenBankaccession No.09-010A绒蚧花翅跳小蜂Microterys spE江苏南京2009/10/12紫薇Lagerstroemia indicaMH11939109-010B绒蚧花翅跳小蜂Microterys spE江苏南京2009/10/12紫薇Lagerstroemia indicaMH11939209-010C绒蚧花翅跳小蜂Microterys spE江苏南京2009/10/12紫薇Lagerstroemia indicaMH11939309-010D绒蚧花翅跳小蜂Microterys spE江苏南京2009/10/12紫薇Lagerstroemia indicaMH11939409-010E绒蚧花翅跳小蜂Microterys spE江苏南京2009/10/12紫薇Lagerstroemia indicaMH119395E2-046A绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci北京海淀2012/07/17紫薇Lagerstroemia indicaMH119396E2-046B绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci北京海淀2012/07/17紫薇Lagerstroemia indicaMH11939710-117绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci江苏南京2009/10/12紫薇Lagerstroemia indicaMH11939810-118A绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci江苏南京2009/10/12紫薇Lagerstroemia indicaMH11939910-118B绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci江苏南京2009/10/12紫薇Lagerstroemia indicaMH119400E3-002A绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci云南文山2013/04/22紫薇Lagerstroemia indicaMH119406E3-002B绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci云南文山2013/04/22紫薇Lagerstroemia indicaMH119407E3-002C绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci云南文山2013/04/22紫薇Lagerstroemia indicaMH119408E4-123A绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci湖北黄冈2014/06/22紫薇Lagerstroemia indicaMH119401E4-123B绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci湖北黄冈2014/06/22紫薇Lagerstroemia indicaMH119402E4-123C绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci湖北黄冈2014/06/22紫薇Lagerstroemia indicaMH119403E4-123D绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci湖北黄冈2014/06/22紫薇Lagerstroemia indicaMH119404E4-123E绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci湖北黄冈2014/06/22紫薇Lagerstroemia indicaMH11940511-092水木坚蚧阔柄跳小蜂Metaphycus corni-ae北京海淀2014/06/20糖槭Acer saccharumMH119409E2-030B水木坚蚧阔柄跳小蜂Metaphycus corni-ae黑龙江哈尔滨2012/06/10糖槭Acer saccharumMH119410E2-030C水木坚蚧阔柄跳小蜂Metaphycus corni-ae黑龙江哈尔滨2012/06/10糖槭Acer saccharumMH119411E2-030D水木坚蚧阔柄跳小蜂Metaphycus corni-ae黑龙江哈尔滨2012/06/10糖槭Acer saccharumMH119412E2-030E水木坚蚧阔柄跳小蜂Metaphycus corni-ae黑龙江哈尔滨2012/06/10糖槭Acer saccharumMH119413E1-190A加蒙阔柄跳小蜂Metaphycus garmon内蒙古贺兰山2010/08/10未知UnknownMH119414E1-190B加蒙阔柄跳小蜂Metaphycus garmon内蒙古贺兰山2010/08/10未知UnknownMH119415E1-190C加蒙阔柄跳小蜂Metaphycus garmon内蒙古贺兰山2010/08/10未知UnknownMH119416E1-190D加蒙阔柄跳小蜂Metaphycus garmon内蒙古贺兰山2010/08/10未知UnknownMH119417E2-122A加蒙阔柄跳小蜂Metaphycus garmon北京昌平2009/04/25未知UnknownMH119418E2-122B加蒙阔柄跳小蜂Metaphycus garmon北京昌平2009/04/25未知UnknownMH119419E2-122C加蒙阔柄跳小蜂Metaphycus garmon北京昌平2009/04/25未知UnknownMH119420E2-122D加蒙阔柄跳小蜂Metaphycus garmon北京昌平2009/04/25未知UnknownMH119421E2-122E加蒙阔柄跳小蜂Metaphycus garmon北京昌平2009/04/25未知UnknownMH119422E2-097杰氏阔柄跳小蜂Metaphycus gerardi云南景洪2012/05/14未知UnknownMH119423E2-189杰氏阔柄跳小蜂Metaphycus gerardi四川攀枝花2009/04/25榕树Figus sp.MH119424E5-117A杰氏阔柄跳小蜂Metaphycus gerardi广西宜州2009/04/25假连翘Duranta repensMH119425E5-117C杰氏阔柄跳小蜂Metaphycus gerardi广西宜州2009/04/25假连翘Duranta repensMH119426E5-117D杰氏阔柄跳小蜂Metaphycus gerardi广西宜州2009/04/25假连翘Duranta repensMH119427E5-117E杰氏阔柄跳小蜂Metaphycus gerardi广西宜州2009/04/25假连翘Duranta repensMH11942808-58亮光阔柄跳小蜂Metaphycus nitens山西五台山2007/07/18未知UnknownMH11942910-007亮光阔柄跳小蜂Metaphycus nitens山西五台山2009/07/20未知UnknownMH11943010-173A亮光阔柄跳小蜂Metaphycus nitens宁夏银川2010/07/06未知UnknownMH11943110-173B亮光阔柄跳小蜂Metaphycus nitens宁夏银川2010/07/06未知UnknownMH11943210-173C亮光阔柄跳小蜂Metaphycus nitens宁夏银川2010/07/06未知UnknownMH119433E1-222A亮光阔柄跳小蜂Metaphycus nitens内蒙古贺兰山2010/08/11未知UnknownMH119434E1-222B亮光阔柄跳小蜂Metaphycus nitens内蒙古贺兰山2010/08/11未知UnknownMH119435E1-222C亮光阔柄跳小蜂Metaphycus nitens内蒙古贺兰山2010/08/11未知UnknownMH11943607_04刷盾跳小蜂(外群)Encyrtus sp. (outgroup)海南五指山2007/05/15未知 UnknownMH119344

2 结果和分析

外部形态特征分类结果显示，本次收集的寄生紫薇绒蚧的跳小蜂为绒蚧阔柄跳小蜂、细柄阔柄跳小蜂Metaphycuscylindricus、绒蚧花翅跳小蜂MicroterysspE和绒蚧皂莫跳小蜂Zaommaeriococci。阔柄跳小蜂属内其他非寄生紫薇绒蚧的种类分别为水木坚蚧阔柄跳小蜂Metaphycuscorniae、加蒙阔柄跳小蜂Metaphycusgarmon、杰氏阔柄跳小蜂Metaphycusgerardi和亮光阔柄跳小蜂Metaphycusnitens。

2.1 COⅠ基因片段序列碱基组成

本研究共获取了93个跳小蜂样本的线粒体COⅠ基因片段序列(GenBank登录号：MH119344～MH119436)，其中，绒蚧阔柄跳小蜂29条、细柄阔柄跳小蜂14条、绒蚧花翅跳小蜂8条、绒蚧皂莫跳小蜂13条、水木坚蚧阔柄跳小蜂5条、加蒙阔柄跳小蜂9条、杰氏阔柄跳小蜂6条、亮光阔柄跳小蜂 8条、刷盾跳小蜂1条。另外，从NCBI数据库中获取黄色阔柄跳小蜂Metaphycusflavus序列1条(GenBank登录号：FM210164)(Pasqueretal.，2009)。截取COⅠ基因序列两端不可靠的碱基后得到长度为612 bp的碱基矩阵。MEGA4分析结果显示，在线粒体COⅠ条形码区域中，A与T的含量非常高(A=28.8%，C=12.4%，G=15.1%，T=43.6%)。GC含量在密码子第三位点平均为8.7%，明显低于第一位点和第二位点(平均为34.4%和39.4%)。共检测到391个保守位点，221个变异位点，R=0.87。

2.2 分子系统树分析

以刷盾跳小蜂为外群，基于94条跳小蜂线粒体COⅠ基因序列数据矩阵构建NJ树，结果(图1)显示，内群93条跳小蜂COⅠ基因序列聚成9个大的分支，并且除黄色阔柄跳小蜂序列少无法统计支持率外，其他每个分支都有>95%的支持率。这9个分支分别对应9个形态种，其中，阔柄跳小蜂属为单系群。此外，绒蚧阔柄跳小蜂分成了2个较为明显的分支，表明该种内部存在较明显的分化。

2.3 种间和种内的遗传距离

应用MEGA4计算9种跳小蜂线粒体COⅠ基因序列的种内与种间遗传距离。结果显示(表2)，绒蚧阔柄跳小蜂的种内遗传距离最大，为0～0.054 9，平均为0.026 5；细柄阔柄跳小蜂和绒蚧皂莫跳小蜂的种内平均遗传距离次之，分别为0.014 7和0.010 4。跳小蜂各种间平均遗传距离为0.073 2～0.186 4(表3)，其中，绒蚧花翅跳小蜂和绒蚧皂莫跳小蜂的种间平均遗传距离最大，为0.186 4；细柄阔柄跳小蜂和黄色阔柄跳小蜂的种间平均遗传距离最小，为0.073 2。对NJ树上绒蚧阔柄跳小蜂2个较明显的分支进行遗传距离分析显示，它们之间的平均遗传距离为0.041 8，分支内平均遗传距离分别为0.018 6(分支1)和0.003 7(分支2)。本研究中 9种跳小蜂线粒体COⅠ基因序列的种内与种间遗传距离显示，各跳小蜂的种内遗传距离与种间遗传距离间没有重叠区域，即种间遗传距离和种内遗传距离之间有间隔(图2)。

表2 9种跳小蜂的种内平均遗传距离Table 2 Intra-species genetic distance of encyrtids

图1 基于跳小蜂COⅠ基因序列构建的邻接树Fig. 1 Neighbour-Joining tree based on the COⅠ sequences of encyrtids

注 Notes： 1. 细柄阔柄跳小蜂Metaphycuscylindricus， 2. 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycuseriococci， 3. 绒蚧花翅跳小蜂MicroterysspE， 4. 绒蚧皂莫跳小蜂Zaommaeriococci， 5. 水木坚蚧阔柄跳小蜂Metaphycuscorniae， 6. 黄色阔柄跳小蜂Metaphycusflavus， 7. 加蒙阔柄跳小蜂Metaphycusgarmon， 8. 杰氏阔柄跳小蜂Metaphycusgerardi， 9. 亮光阔柄跳小蜂Metaphycusnitens

图2 9种跳小蜂COⅠ基因序列的种内与种间遗传距离的分布频率(K2P模型)Fig. 2 Frequency distribution of the intra- and inter-species genetic distances of 9 encyrtid species based on COⅠ sequences (K2P model)

3 讨论

本研究利用DNA条形码技术鉴别了我国9种跳小蜂，其种间遗传距离远大于种内遗传距离，且两者没有重叠，表明DNA条形码技术能区别我国寄生紫薇绒蚧的跳小蜂种类。研究结果显示，属间的遗传距离大于属内不同种间，并且NJ树显示寄生紫薇绒蚧的几种跳小蜂各聚类成单系群，表明DNA条形码能够区分这9种跳小蜂。这与之前关于利用DNA条形码鉴别跳小蜂种类的研究结论(Zhangetal.，2011；Chestersetal.，2012)一致。

本研究中，阔柄跳小蜂属的种类属于同一个种团，亲缘关系相近，形态差别很小(Wangetal.，2014)。但是DNA条形码分析结果显示，它们之间的遗传距离远大于目前DNA条形码研究中通用的分种标准(遗传距离>4%)。这表明DNA条形码技术对同属的跳小蜂近缘种具有很好的识别效果。另外，DNA条形码技术也有助于了解物种内的分子变异程度。研究结果显示，绒蚧阔柄跳小蜂的COⅠ基因序列聚成2个分支，并且2个分支间的平均遗传距离较大。但是观察这2个分支上的样本，其外部形态几乎没有差别或差别极小，在地理分布上，这2个分支上的样本明显重叠，这种遗传结构形成的机制或是否存在隐存种需要进一步研究。

跳小蜂种类较多，寄生关系比较复杂，且对于我国跳小蜂种类和寄生关系也缺乏系统深入的调查。本研究使用的跳小蜂种类有限，特别是同属种类较少，因此，基于COⅠ基因计算跳小蜂的种内和种间遗传距离是否存在间隔还有待进一步研究。本研究中9种跳小蜂的种内和种间遗传距离不存在重叠，且进化树上各形态种形成单系，表明了DNA条形码技术可以快速、准确地鉴别这几种寄生紫薇绒蚧跳小蜂。随着未来其他寄生蜂种类COⅠ基因序列信息的不断补充与完善，DNA条形码技术必将对研究我国蚧虫寄生蜂的物种识别、阐明寄生蜂对寄主的专化性规律和利用寄生蜂开展有效的生物防治产生积极的推动作用。