企鹅珍珠贝抗氧化系统对铜暴露的响应

严俊贤，李有宁，于 刚，吴开畅，马振华，陈明强

( 1.中国水产科学研究院 南海水产研究所，热带水产研究开发中心，海南 三亚 572018； 2.中国水产科学研究院 南海水产研究所，农业部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东 广州 510300 )

近年来，近海海域受到人类活动的影响越来越大，海洋受到重金属的污染也日益严重。重金属能够在生物体内积蓄，沿食物链富集，威胁海洋生物生产以及人类食品安全[1-2]。铜(Cu)是海洋环境中最常见的重金属污染物之一，金属冶炼、机械制造、有机化工等均排放大量的含铜废水。铜离子经陆地水系迁移至海洋造成部分近海海域的铜含量偏高，危害海洋生物的生存[3]。铜是生物体所需的微量元素，参与多种酶的形成与反应，但过量的铜与生物重要分子非特异性结合产生毒性，严重者导致DNA分子断裂[4-6]，对生物幼体的危害尤大[7-8]。用于生产附壳珍珠的企鹅珍珠贝(Pteriapenguin)是我国海水珍珠养殖业的主要经济种类之一，在海南、广东以及广西海域大量养殖[9]。海洋双壳贝类体表可吸收、吸附和摄食积累海洋中的重金属，其抗氧化系统对重金属的污染反应灵敏，是监测海域重金属污染的重要物种[10-11]。目前，已利用紫贻贝(Mytilusedulis)体内的生物标志物对重金属敏感的特点监测海区的重金属污染程度，早期预警环境污染[12-14]。生物体内的抗氧化酶活性，如谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶等是重金属污染的生物标志之一，能够反映重金属污染物对机体的伤害程度，诊断环境中的重金属污染。目前，缢蛏(Sinonovaculaconstricta)、贻贝、文蛤(Meretrximeretrxi)、牡蛎等海洋双壳类对重金属污染的抗氧化酶活性已有较多的研究报道[15-20]，但有关铜污染对企鹅珍珠贝的抗氧化系统的影响却罕见报道。笔者将企鹅珍珠贝暴露于一定铜含量条件下，探索肝胰腺组织中谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性的变化规律，进一步了解企鹅珍珠贝在重金属影响下的生理机制，为拓展海洋环境监测手段提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用分析纯五水硫酸铜购自国药集团化学试剂有限公司。试验用海水取自海南省陵水县新村港海域，经48 h暗沉淀、砂滤以及紫外消毒处理，盐度为33.1。试验用1龄企鹅珍珠贝，壳长(86.72±8.59) mm，壳高(82.01±5.46) mm，壳宽(30.25±2.47) mm，体质量(88.24±13.32) g，采自陵水县黎安港，在0.7 m3水泥池中暂养15 d。期间投喂球等边金藻(Isochrysisgalbana)，平均水温为(27.6±1.0) ℃。试验前1 d停止投饵，选择反应灵敏、闭合力强、体质量及规格相近的企鹅珍珠贝作为试验对象。用南京建成生物研究所生产的试剂盒测定谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的抗氧化酶活性。

1.2 方法

试验在容积为0.2 m3玻璃钢水桶中进行。试验期间，每日更换Cu2+溶液1次，24 h持续充气，贝密度为0.1个/L。根据已有的研究结果[15,21]，设计3个Cu2+质量浓度组和对照组，质量浓度分别为10、20、40 μg/L，每个处理3个平行。暴露时间为96 h，试验期间不投饵，分别于0、6、12、24、48、72、96 h随机取样，测定谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性(U/mg)。取试验贝肝胰腺0.5 g，剔除结缔组织，用消毒生理盐水冲洗，置于离心管内液氮速冻，于-80 ℃冰箱保存，用于测定抗氧化酶活性。

1.3 数据处理

试验数据用平均数±标准差表示，利用统计软件SPSS 19.0对活性系数进行单因素方差分析，得到组间的差异显著性；利用作图软件SigmaPlot 12.0作图。

2 结 果

2.1 不同铜质量浓度下企鹅珍珠贝肝胰脏中谷胱甘肽过氧化物酶的活性

对照组企鹅珍珠贝的谷胱甘肽过氧化物酶活性变化很小(P>0.05)，说明在未添加Cu2+的海水中，谷胱甘肽过氧化物酶活力相对稳定，其他3组企鹅珍珠贝肝胰脏中抗氧化酶的活性则随时间的推延而增长。Cu2+质量浓度为10 μg/L时，96 h内谷胱甘肽过氧化物酶活性持续上升，72 h活性最高，两者间差异不显著(P>0.05)；12～24 h谷胱甘肽过氧化物酶活性显著提高(P<0.05)，而24 h之后酶活力变化平稳。20 μg/L时，0～6 h谷胱甘肽过氧化物酶活力激增(P<0.05)，72～96 h则明显下降(P<0.05)，12 h活性最高，12～72 h则保持较高的活力水平。随暴露时间的延长，40 μg/L试验组谷胱甘肽过氧化物酶活性平稳升高，72 h达到峰值，随后则平稳下降，该组的峰值不及前2组的峰值高(图1)。

2.2 不同铜质量浓度下企鹅珍珠贝肝胰脏中过氧化氢酶的活性

96 h内对照组企鹅珍珠贝肝胰脏中过氧化氢酶的活性较稳定。10 μg/L Cu2+质量浓度组肝胰脏中过氧化氢酶活性在24 h内增幅不大(P>0.05)，48 h则活力明显升高，随后又明显下降(P<0.05)。20 μg/L Cu2+质量浓度组的过氧化氢酶活性则随时间推移持续上升，72 h达最大值，96 h则保持相对平稳的水平(P>0.05)。暴露于40 μg/L Cu2+质量浓度组的过氧化氢酶活力则出现“上升—下降”的变化规律，暴露6 h 酶活性显著升高(P<0.01)，直至48 h仍然保持较高活力，72 h明显下降(P<0.05)。10 μg/L Cu2+质量浓度组过氧化氢酶活性的峰值均显著低于20 μg/L 和40 μg/L Cu2+质量浓度组的最高值(图2)。

图1 不同Cu2+质量浓度下企鹅珍珠贝肝胰脏中谷胱甘肽过氧化物酶的活性

图2 不同Cu2+质量浓度下企鹅珍珠贝肝胰脏中过氧化氢酶的活性

2.2 不同铜质量浓度下企鹅珍珠贝肝胰脏中超氧化物歧化酶的活性

试验期间对照组企鹅珍珠贝肝胰脏中的超氧化物歧化酶活性一直较低，而10 μg/L Cu2+质量浓度组超氧化物歧化酶活性则随时间的延长而上升趋势，72 h达到最大值，96 h活性显著下降(P<0.01)。Cu2+质量浓度为20 μg/L时，超氧化物歧化酶活性呈“上升—下降”的变化趋势，峰值出现在24 h，随后平稳下降。Cu2+质量浓度为40 μg/L组企鹅珍珠贝肝胰脏中的超氧化物歧化酶活性在96 h内平稳增长，96 h酶活性最大，而24 h便进入相对稳定的较高酶活性水平(图3)。

图3 不同Cu2+质量浓度下企鹅珍珠贝肝胰脏中超氧化物歧化酶的活性

3 讨 论

3.1 重金属铜对企鹅珍珠贝肝胰脏抗氧化酶活性的影响

环境中的重金属进入无脊椎动物体内，会诱导产生大量的活性氧产物，包括过氧化氢、游离态氧等。这些活性氧产物的积累使机体中多不饱和脂肪酸被过氧化或造成DNA氧化损伤等，体内的抗氧化系统便会激活，清除活性氧、抵御氧化损伤[22-23]。超氧化物歧化酶可将OH和O2-转化为O2和H2O2；过氧化氢酶将有害物质H2O2分解成O2和H2O；谷胱甘肽过氧化物酶则作为底物可分解多种过氧化物[24-26]。这些抗氧化酶构成了主要保护酶系统，防御机体氧化损伤。企鹅珍珠贝暴露在20 μg/L质量浓度Cu2+时，谷胱甘肽过氧化物酶活性在短时间内快速上升，而40 μg/L质量浓度组则上升缓慢，说明高质量浓度铜对肝胰腺中细胞起到一定的损伤，限制了谷胱甘肽过氧化物酶活性的提升。在40 μg/L质量浓度下，过氧化氢酶活性在短时间内便快速上升，显著高于其他剂量组，说明高质量浓度Cu2+溶液对过氧化氢酶活性的诱导较灵敏。在Cu2+污染时12 h内超氧化物歧化酶活性被逐渐诱导，随着活性氧产物的诱导增加，在12 h后达到较高活性，而40 μg/L质量浓度组中，直至96 h，肝胰腺中超氧化物歧化酶活性仍然保持较高的活性，说明较高质量浓度Cu2+可持续诱导超氧化物歧化酶的活性。其他贝类如菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)在铜污染下抗氧化酶先诱导后抑制，大量活性氧产物未能及时清除，机体受到损失并使酶活力受到抑制[27]。而本研究中，重金属铜对企鹅珍珠贝肝胰脏中的抗氧化酶均无明显的抑制作用，说明抗氧化酶对活性氧产物的清除能力较强，企鹅珍珠贝肝胰脏组织对铜污染具有一定的耐受能力。

3.2 抗氧化酶对重金属铜的灵敏度

铜是多种清池消毒剂、杀虫农药等的主要成分，农业环境中残留量较大，对生态环境的污染日益严重。挖掘生物体内的监测指标可有效发现生存环境的污染程度，抗氧化酶则是一类灵敏度较高的分子生态毒理学指示物。有研究表明，不同含量Cu2+污染时，长牡蛎(Crassostreagigas)闭壳肌、鳃和消化腺中的抗氧化酶系统随时间推移呈“上升—峰值—下降”的变化规律，而消化腺的敏感性则为最高，因此，长牡蛎消化腺中的抗氧化酶对环境中Cu2+有一定指示作用[28]。企鹅珍珠贝肝胰腺中的谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性在Cu2+作用下出现一定的变化规律，不同质量浓度Cu2+污染对机体氧化损伤程度不同，因而抗氧化酶的灵敏度各不相同。受到污染时抗氧化酶活性可诱导或抑制，可作为生态污染监测的标志物[29-33]。本研究中，企鹅珍珠贝的谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性与污染物有显著的“时间—含量—活性”相关效应，可作为重金属Cu2+污染的监测标志物，肝胰腺中抗氧化酶灵敏度依次为谷胱甘肽过氧化物酶>过氧化氢酶>超氧化物歧化酶。