黄精速溶粉抗氧化活性及对氧化损伤小鼠的保护作用

伏有为，李彦妮，陈文军

（安徽医科大学公共卫生学院，安徽合肥230032）

黄精为百合科多年生草本植物黄精（Polygonatum sibricum Red.）、滇黄精（Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.）或多花黄精（Polygonatum cyrtonema Hua）的干燥根茎[1]。黄精始载于晋代《名医别录》，具有滋阴润肺、健脾益肾等作用，同时也是我国卫计委公布的药食同源植物之一。现代研究显示，黄精具有抗氧化、降血糖、改善学习记忆、抗动脉粥样硬化、免疫调节等多种生物活性[2]。乙醇进入机体后主要在肝脏内氧化代谢并产生大量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），致使机体氧化还原失衡，诱导肝脏脂质过氧化、线粒体损伤、炎性细胞因子释放和肝细胞凋亡，导致肝脏氧化应激损伤[3]。研究发现，黄精可通过提高小鼠肝脏的抗氧化水平，对四氯化碳所致化学性肝损伤发挥保护作用[4]，然而黄精对乙醇所诱导的肝脏氧化损伤是否有保护作用目前国内外尚未见明确报道。鉴于此，本文采用经五蒸五晒、打浆、蒸馏、雾化、固化等技术制得的黄精速溶粉（polygonatum sibricum instant powder，PSIP）作为研究对象，首先研究其体外抗氧化活性，然后以急性乙醇暴露致肝脏氧化损伤小鼠为模型，进一步探究黄精速溶粉的体内抗氧化活性和对小鼠肝脏的保护作用，以期为深度开发利用黄精奠定基础。

1 材料

1.1 药物及试剂

黄精速溶粉（20170308）：安徽精天有限公司；谷丙转 氨 酶 （alanine aminotransferase，ALT） 试 剂 盒（20171014）、谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）试剂盒（20171018）、甘油三酯（triglyceride，TG）试剂盒（20171014）、总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）试剂盒（20170509）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）试剂盒（20170518）、BCA 法蛋白定量试剂盒（20170520）：南京建成生物工程研究所；2，4-二硝基苯肼（20130510）：国药集团化学试剂有限公司；硫酸链霉素（E22811C251）、盐酸胍（EZ2811D335）：德国Biofroxx公司；二硫双基苯甲酸（Y16M8K30650）：上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器

Synergy H4全功能酶标仪：美国伯腾仪器公司；UV-1200紫外分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；ME104E电子天平：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；Allegra64R台式高速冷冻离心机：美国贝克曼库尔特公司；Bullet Blender组织细胞破碎仪：美国Next Advance公司；立式超低温保存箱：青岛海尔特种电器有限公司。

1.3 实验动物及饲料

昆明种雄性 8周龄 SPF 级小鼠，体重（40±2）g：北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）2016-0011。舒克贝塔牌SPF级小鼠维持粮（总能量3 616 kcal/kg，三大营养素供能比为蛋白质20.6%，脂肪12.0%，碳水化合物67.4%）：江苏协同医药生物工程有限责任公司。

2 方法

2.1 PSIP体外抗氧化活性研究

2.1.1 PSIP清除超氧阴离子自由基活性

参考文献[4-5]的方法，在10 mL比色管中加入0.05 mol/L Tric-HCl（pH=8.2）缓冲液4.5 mL，置于25℃水浴中预热20 min，依次加入不同质量浓度的PSIP溶液2 mL、25 mmol/L邻苯三酚溶液1 mL，混匀，25℃水浴中反应5 min（从加入邻苯三酚开始计时），再加入8 mol/L HCl溶液1 mL终止反应，静置10 min，325 nm处测定A值（Ai）；以10 mmol/L HCl溶液代替邻苯三酚测得本底A值（Aj）；以水代替样品测得空白A值（A0），计算超氧阴离子自由基清除率：

2.1.2 PSIP清除羟基自由基活性

参考汪荔等[6]的方法，在10 mL比色管中依次加入不同质量浓度的PSIP溶液2 mL、6 mmol/L FeSO4溶液2 mL、6 mmol/L H2O2溶液 2 mL，混匀，静置 10 min；再加入6 mmol/L水杨酸乙醇溶液2 mL，混匀，37℃保温30 min，510 nm下测得不同PSIP浓度A值（Ai）；以水代替水杨酸乙醇测得本底A值（Aj）；以水代替样品测得空白A值（A0），计算羟自由基清除率：

2.2 体内试验

2.2.1 动物饲养及干预

将50只昆明鼠，随机分成5组，即对照组、模型组和PSIP低、中、高剂量组，每组10只，单笼饲养，自由进食饮水。经适应性喂养1周后，3个剂量组给予不同浓度的PSIP溶液，模型组和对照组给予同体积溶剂，连续灌胃30 d，末次灌胃后，模型组和3个剂量组禁食16h（过夜），然后一次性灌胃给予50%乙醇12mL/kg BW，6小时后处死取血，3 500 r/min离心15 min分离血清。快速取出肝脏，生理盐水冲洗，滤纸吸去多余的生理盐水，称重计算肝指数（liver index，LI）/%=（肝重/体重）×100，-80℃保存，（对照组不禁食取材）。

2.2.2 肝损伤相关指标测定

采用赖氏法测定血清中ALT、AST活力，磷酸甘油氧化酶-过氧化物酶偶联法检测小鼠肝脏中TG含量，具体操作按照试剂盒说明书方法。

2.2.3 肝脏组织中氧化/抗氧化相关指标测定

采用硫代巴比妥酸法测定MDA的量，黄嘌呤氧化酶法测定T-SOD活力，具体操作按照试剂盒说明书方法。2，4-二硝基苯肼比色法[7]测定蛋白质羰基（protein carbonyl，PCO）的量。

Beutler改良法测定还原性谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）的量，取冻存的肝组织用0.85%生理盐水制成10%组织匀浆，4 000 r/min离心10 min取上清液。按上清液：20%三氯乙酸为3∶1混合，12 000 r/min离心10 min，收集上清液。取上清液0.1 mL，加入0.3 mol/L磷酸氢二钠缓冲液4.4 mL，0.04%二硫双基苯甲酸溶液0.5 mL，混匀，5 min内于412 nm测定A值，蒸馏水调零。根据GSH标准曲线计算肝脏组织中GSH的量。BCA法测定组织匀浆上清液的蛋白浓度，具体操作按试剂盒说明书方法。

2.3 统计学分析

定量资料以±S（平均值±标准差）表示，采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析，最小显著差异法（least significant difference，LSD）进行多重比较，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 PSIP对超氧阴离子自由基的清除作用

PSIP体外对自由基的清除作用见图1。

图1 PSIP体外对自由基的清除作用Fig.1 Free radical scavenging activity of PSIP in vitro

从图1可知，在1 mg/mL～50 mg/mL质量浓度范围内，PSIP对超氧阴离子自由基的清除率随着浓度的增加而逐渐升高，几乎呈线性关系，呈现出良好的量效关系，其IC50值为34.85 mg/mL。

3.2 PSIP对羟基自由基的清除作用

图1结果显示，PSIP对·OH有清除作用，且清除率随着PSIP质量浓度（1 mg/mL～50 mg/mL）的增加而不断增加，表明PSIP的质量浓度与·OH清除率呈一定的量效关系，其IC50值为20.63 mg/mL。

3.3 PSIP对小鼠LI、ALT和AST活力及TG水平的影响

PSIP对小鼠LI以及血清中ALT、AST活力和TG水平的影响见表1。

由表1可知，各试验组小鼠肝指数之间差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组相比，模型组小鼠血清中ALT、AST活力和TG水平显著增高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，PSIP各剂量组均能显著降低小鼠血清中转氨酶的活力以及TG水平，差异具有统计学意义（P＜0.05、P＜0.01）；并且 PSIP 中高剂量组小鼠血清中转氨酶活力与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

3.4 PSIP对小鼠MDA、PCO、GSH水平及T-SOD活力的水平的影响

PSIP对小鼠肝脏组织中MDA、PCO、GSH水平及T-SOD活力的影响见表2。

由表2可知，与对照组相比，模型组小鼠肝脏中脂质氧化产物MDA蛋白质氧化产物PCO水平显著增高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；抗氧化物质GSH水平和T-SOD活力显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，PSIP各剂量组小鼠肝脏组织中MDA水平显著降低GSH水平显著增高，差异具有统计学意义（P＜0.05、P＜0.01）；同时 PSIP 中、高剂量组小鼠肝脏组织中PCO水平显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.01），T-SOD活力显著增高，差异具有统计学意义（P＜0.05、P＜0.01）。当给予高剂量的 PSIP 灌胃时（2.60 g/kgBW），能同时将小鼠肝脏组织中MDA、PCO、GSH、T-SOD恢复至对照组水平（P＞0.05）。

表1 PSIP对乙醇氧化损伤小鼠LI、ALT和AST活力及TG水平的影响（±s，n=10）Table1 Effect of PSIP on LI and activities of ALT，AST and levels of TG in ethanol-induced oxidative damaged mice（±s，n=10）

表1 PSIP对乙醇氧化损伤小鼠LI、ALT和AST活力及TG水平的影响（±s，n=10）Table1 Effect of PSIP on LI and activities of ALT，AST and levels of TG in ethanol-induced oxidative damaged mice（±s，n=10）

注：与对照组比较，*P＜0.05**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05 △△P＜0.01。“-”表示未给予 PSIP 处理。

组别剂量/（g/kgBW）LIALT/（U/L）AST/（U/L）TG/（mmol/L）PSIP 0.65 4.01±0.17 37.09±9.56△* 44.06±8.21△** 2.02±0.48△**PSIP 1.30 3.94±0.24 30.11±12.19△△ 38.08±10.47△△ 1.89±0.42△△**PSIP 2.60 4.02±0.36 27.97±10.48△△ 28.09±10.02△△ 1.63±0.16△△**模型 - 4.10±0.20 47.60±9.95** 53.77±11.23** 2.35±0.23**对照 - 4.16±0.23 27.01±9.52△△ 29.32±7.37△△ 0.87±0.38△△

表2 PSIP对乙醇氧化损伤小鼠MDA、PCO、GSH水平和T-SOD活力的影响（±s，n=10）Table2 Effect of PSIP on levels of MDA，PCO，GSH and activities of T-SOD in ethanol-induced oxidative damaged mice（±s，n=10）

表2 PSIP对乙醇氧化损伤小鼠MDA、PCO、GSH水平和T-SOD活力的影响（±s，n=10）Table2 Effect of PSIP on levels of MDA，PCO，GSH and activities of T-SOD in ethanol-induced oxidative damaged mice（±s，n=10）

注：与对照组比较，*P＜0.05**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05 △△P＜0.01。“-”表示未给予 PSIP 处理。

组别剂量/（g/kgBW）MDA/（nmol/mgprot）PCO/（nmol/mgprot）GSH/（μmol/gprot）T-SOD/（U/mgprot）PSIP 0.65 0.81±0.172△** 5.15±0.55* 25.55±3.38△ 210.21±18.36*PSIP 1.30 0.74±0.046△△** 4.36±0.93△△ 27.67±3.01△△ 237.15±22.40△PSIP 2.60 0.69±0.097△△ 3.61±0.93△△ 33.08±5.72△△ 251.41±36.59△△模型 - 0.93±0.161** 5.85±1.00** 20.05±7.19** 207.48±31.93**对照 - 0.58±0.115△△ 4.04±1.12△△ 29.28±5.28△△ 239.94±16.03△△

4 结果与讨论

目前，酒精滥用与酒精中毒已成为全球范围内重要的公共卫生问题，酒精性肝病被认为是世界范围内发病率和死亡率的主要原因[8]。在美国酒精性肝炎患者确诊后一个月内死亡率高达20%～30%[9]。在我国，酒精性肝病的发病率逐年上升，已成为继病毒性肝炎之后的第二大肝脏疾病[10]。虽然目前对酒精性肝病潜在的发病机制尚不明确，但研究发现氧化应激在酒精性肝病的发生发展中具有重要作用[11]。摄入体内的酒精90%以上在肝脏中经脱氢酶氧化代谢为乙酸盐，在此过程中会生成大量的ROS副产物，造成细胞内蛋白质损伤、脂质沉积及过氧化和DNA交联，且线粒体和细胞核中的DNA损伤甚至可能阻断基因组的复制和转录，进一步导致基因突变或染色体畸变[12]。天然的抗氧化物质能够降低乙醇诱导的细胞中脂质、蛋白质和核酸的损伤，发挥保护作用[13]。

研究发现，多种植物提取物具有明显的抗氧化活性如在采用姜黄[14]和柘树叶[15]提取物干预后，可显著提高急性乙醇暴露小鼠肝脏中SOD活力与GSH水平，降低肝脏细胞氧化应激水平。细胞试验显示，在1 μmol/L～30 μmol/L范围内穿心莲内酯能以剂量依赖的方式降低乙醇所致肝细胞中ROS和MDA的产生[16]。水飞蓟油可提高D-半乳糖模型小鼠血清中SOD等抗氧化酶活力，并使其恢复至正常水平[17]。本研究中体外抗氧化试验显示，PSIP对羟基自由基和超氧阴离子自由基均有较明显的清除作用，且在1 mg/mL～50 mg/mL质量范围内表现出良好的量效关系。在动物试验中，与对照组相比模型组小鼠血清中ALT活力增高76.2%、AST活力增高83.4%、TG水平增高170.1%，且两组相比差异具有统计学意义（P＜0.01），表明采用50%乙醇12 mL/kgBW的剂量可明显诱导小鼠肝脏产生急性损伤和脂质沉积。与模型组相比，连续给予小鼠30 d PSIP后可明显降低小鼠血清中ALT、AST活力和TG水平，且PSIP在中剂量时即可将ALT与AST活力调至对照组水平，表明PSIP具有保护肝脏和调节脂质沉积作用；同时给予PSIP后可降低小鼠肝脏中氧化产物MDA和PCO水平提高抗氧化物质GSH水平和TSOD活力，而且PSIP在中剂量时即可将上述指标（除MDA）均回调至对照组水平。

以上试验结果说明，PSIP具有明显的体外抗氧化活性，并且可通过提高机体抗氧化水平，减轻肝脏氧化应激水平，调节脂质沉积，从而对急性乙醇暴露导致的小鼠肝脏损伤发挥保护作用。