泰山灰树花母种及液体菌种最佳培养条件的研究

刘姗姗，孟丽，赵姣姣，王丽颖，朱孟娟

（山东农业大学植物保护学院，山东泰安271018）

泰山灰树花（Grifola frondosa）是泰山特有的一种野生珍稀食药用真菌，其肉质脆嫩、香味浓郁，味道鲜美，口味极佳，深受当地人们的喜爱[1]。多分布于海拔700 m～1 100 m的范围内，在泰山的夏、秋季节，常生长于栗树等阔叶树的周围[2]。

从分类上来说，泰山灰树花属于层菌纲（Hymenomycetes）、非褶菌目（Aphyllophorales）、多孔菌科（Polyporaceae）、灰树花属（Ramalina），它的子实体呈珊瑚状分枝，末端扇形或匙形，重叠成簇[3-4]。灰树花不仅富含高质量的氨基酸、膳食纤维、微量元素、维生素、有机酸等[5]，还含有很多活性物质如多糖[6-8]、糖蛋白[9-10]、蛋白质或肽类[11-12]等，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、降血脂、降胆固醇、调节血糖、抑制糖尿病、提高免疫力等功效，是一种极具开发价值的功能性食药用真菌[13-18]。

有关泰山灰树花的研究主要集中在生物学特性、人工栽培、海藻糖及多糖的提取3个方面。苏延友等研究了泰山灰树花的生物学特性及人工培育技术[2]。有研究报道，泰山灰树花子实体的最适生长温度为22℃左右，环境相对湿度为90%，生长阶段要求有较强的散射光，可覆土栽培[19]。李艳玲等对泰山灰树花液体深层发酵的培养基进行了优化并从中提取了海藻糖[20]。李晓倩则通过微波辅助的方法从泰山灰树花菌丝体中提取了多糖物质[21]。在以上的研究中，研究者对泰山灰树花母种培养条件的研究大多不系统，而且缺少泰山灰树花液体菌种培养方面的相关报道。因此，本研究将对泰山灰树花母种和液体菌种的最佳培养条件进行研究，以补充和填补相关数据，为泰山灰树花的人工栽培提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

泰山灰树花4号：山东农业大学菌物基地保存。

1.1.2 培养基

基础培养基：葡萄糖20g，蛋白胨2 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，琼脂 20 g，水 1 L，pH 值自然。

液体培养基：葡萄糖20g，酵母膏2 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，水 1 L，pH 自然。

1.1.3 试剂与设备

葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、MgSO4、琼脂：购于山东省泰安市普天公司。

SW-CJ-2F双人双面超净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；G180T立式自动压力蒸汽灭菌锅：致微仪器有限公司；H2P-250全温培养振荡器：上海精宏实验设备有限公司；DGT-G250电热鼓风干燥箱：合肥华德科学器材有限公司；RXZ-380A-LED智能人工气候箱：宁波江南仪器厂；SHP-250生化培养箱：上海培因实验仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 泰山灰树花母种培养基最适碳源的筛选

采用单因素试验法，在基础培养基的基础上，分别以葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉5种糖作为碳源，依次代替基础培养基中的葡萄糖，制备相应的培养基，共制备5种不同碳源的培养基。121℃灭菌30 min后，倒入直径为90 mm的无菌平板中，冷却待用。利用打孔器将准备好的泰山灰树花平板菌种打成直径7 mm的圆形菌片，定量接种于上述做好的平板培养基中央，每个平板接种一个菌片，每种培养基接种3个平板。接种完成后，置于24℃恒温培养箱中黑暗培养，3天后每天定时测量并记录菌丝的生长长度（十字交叉法测量）、长势及边缘的整齐度，并计算菌丝的日均增长量。

Affected individuals carry the risk for colorectal,endometrial and ovary, genitourinary tract, stomach, hepatobiliary, pancreas and small bowel cancers (Figure 3).

1.2.2 泰山灰树花母种培养基最适氮源的筛选

分别以蛋白胨、酵母膏、尿素、NH4NO3作为氮源，依次代替基础培养基中的蛋白胨，参照1.2.1中的方法制作平板培养基并接种，每种培养基接种3个平板，然后置于24℃恒温培养箱中黑暗培养，3天后每天定时测量并记录菌丝的生长长度（十字交叉法测量）、长势及边缘的整齐度，并计算菌丝的日均增长量。

1.2.3 测定不同添加物对泰山灰树花菌丝生长的影响

参照1.2.1和1.2.2的试验结果，设计本试验的培养基配方为：葡萄糖20 g，酵母膏2 g，添加物100 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，琼脂 20 g，水 1 L，pH 值自然。添加物分别为栗树木屑和栗树树叶。具体操作为：先将添加物放入水中煮沸10 min，过滤取滤液，然后再加入葡萄糖、酵母膏等其它成分，制作成培养基。121℃灭菌30 min后，倒入直径为90 mm的平板中，冷却待用。利用打孔器将准备好的泰山灰树花平板菌种打成圆形菌片，定量接种于上述做好的平板培养基中央，每个平板接种一个菌片，每种添加物培养基做3个重复。接种完成后，置于24℃恒温培养箱中黑暗培养，3天后每天定时测量并记录菌丝的生长长度（十字交叉法测量）、长势及边缘的整齐度，并计算菌丝的日均增长量。

1.2.4 测定泰山灰树花菌丝生长的最适温度

参照1.2.1、1.2.2和1.2.3的试验结果，确定本试验的培养基配方为：葡萄糖20 g，酵母膏2 g，栗树木屑100 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，琼脂 20 g，水 1 L，pH值自然。按照培养基配方制作培养基并灭菌待用。按照1.2.1的方法定量接种后，分别置于22、24、26、28、30℃恒温培养箱中培养，每个温度设3个重复。3天后每天定时测量并记录菌丝的生长长度（十字交叉法测量）、长势及边缘的整齐度，并计算菌丝的日均增长量。

参照1.2.1、1.2.2和1.2.3的试验结果，确定本试验的培养基配方为：葡萄糖20 g，酵母膏2 g，栗树木屑100 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，水 1 L，pH 值自然。按照培养基配方制作液体培养基，倒入250 mL的三角瓶中，每瓶150 mL，然后用1 mol/L的HCl和NaOH调节培养基的 pH 值，使其分别为 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，每种pH值设置3个重复，121℃灭菌30 min后，冷却待用。分别用打孔器取泰山灰树花平板菌种6片接种于三角瓶内，然后置于温度为24℃、转速为160 r/min的恒温振荡培养箱中振荡培养。10天后测定培养液中菌丝体的干重。

1.2.5 泰山灰树花液体菌种培养条件的优化

利用正交试验设计法，以转速、接种量和温度为3个因素，以菌丝体干重为参考指标，进行三因素三水平的正交试验，具体设计参照表1。

表1 正交试验因素和水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiment

本试验的液体培养基配方同试验1.2.4。按照培养基配方制作培养基后，倒入250 mL的三角瓶中，每瓶150 mL，共制作27瓶。然后参照表1中的参数，将事先准备好的泰山灰树花液体菌种摇匀后用移液管定量接种到三角瓶中，每个试验设3个重复。接种完成后，参照表1的培养条件进行培养。10天后测定每瓶发酵液中菌丝体的干重。

1.2.7 数据分析与处理

所有试验设置3个重复，结果以平均值±标准差的形式表示。

2 结果与分析

2.1 泰山灰树花母种培养基最适碳源的筛选

利用单因素试验法，分别以葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉5种糖作为碳源，测定其对泰山灰树花菌丝生长的影响，试验结果如表2所示。

表2 不同碳源对泰山灰树花菌丝生长的影响Table2 The effect of different carbon sources on the growth of Taishan Grifola frondosa mycelium

从表2中可以看出，以葡萄糖作为碳源，培养得到的菌落直径最大（73.10 mm），且菌落边缘整齐，菌丝颜色洁白。以果糖作为碳源培养的的菌落直径和以麦芽糖为碳源培养的菌落直径虽然相差不大，但果糖作为碳源培养的的菌落边缘比麦芽糖为碳源培养的菌落边缘整齐。以蔗糖和淀粉作为碳源培养的菌落直径最小。综上分析可知，泰山灰树花菌丝生长最适碳源为葡萄糖。

2.2 泰山灰树花母种培养基最适氮源的筛选

分别以酵母膏、蛋白胨、尿素和硝酸铵作为氮源，测定其对泰山灰树花菌丝生长的影响，试验结果如表3所示。

表3 不同氮源对泰山灰树花菌丝生长的影响Table3 The effect of different nitrogen sources on the growth of Taishan Grifola frondosa mycelium

从表3中可以看出，培养10天后，以酵母膏作为氮源培养的菌落直径最大，为58.25 mm，而且菌丝洁白，菌落边缘整齐。在蛋白胨和硝酸铵作为氮源的培养基上，菌丝长速相差不大，但在以硝酸铵为氮源的培养基上，菌落边缘不规则。在以尿素为氮源的培养基上，菌丝不能生长。综上分析，泰山灰树花最最适的氮源为酵母膏。

2.3 测定不同添加物对泰山灰树花菌丝生长的影响

通过测定不同添加物对泰山灰树花菌丝生长的影响，得到结果如表4所示。

表4 不同添加物对泰山灰树花菌丝生长的影响Table4 The effect of different additives on the growth of Taishan Grifola frondosa mycelium

从表4中可以看出，与对照组相比，添加栗树木屑和栗树树叶都能够在一定程度上促进菌丝的生长，但添加栗树木屑后，菌丝生长的速度最快，到第10天时菌落直径达到78.83 mm，而且菌丝洁白，菌落边缘整齐。

2.4 测定泰山灰树花菌丝生长的最适温度

分别测定不同温度对泰山灰树花菌丝生长的影响。结果如表5所示。

表5 不同温度对泰山灰树花菌丝生长的影响Table5 The effect of different temperature on the growth of Taishan Grifola frondosa mycelium

从表5中可以看出，在20℃～30℃的范围内，菌丝均能生长。但温度在24℃时，菌丝生长10天后，菌落的直径最大，菌丝生长速度最快，且菌落边缘整齐，所以培养泰山灰树花菌丝的最适温度为24℃。

2.5 测定泰山灰树花菌丝生长的最适pH值

通过测定不同pH值下泰山灰树花菌丝生长10天后的菌丝体干重，得到表6。

表6 不同酸碱度对泰山灰树花菌丝生长的影响Table6 The effect of different pH on the growth of Taishan Grifola frondosa mycelium

从表6中可以看出，在pH值为6时，菌丝体的干重最多，且菌丝球数量最多，密实。在pH值为5时，菌丝体干重稍小一些，但菌丝球也很多，说明在pH值5～6的范围内，菌丝生长状况最好，最适合的pH值为6。pH值低于5或高于6时，菌丝生长状况不佳。

2.6 泰山灰树花液体菌种培养条件的优化

以转速、接种量和温度为3个因素，以菌丝体干重为参考指标，对泰山灰树花液体菌种培养条件进行三因素三水平的正交试验，结果如表7所示。

分析表7中的R值可知，这3个因素对泰山灰树花液体菌种的影响程度依次为B＞A＞C，即接种量＞转速＞温度。分析表中的K值，可以看出各因素水平优选的最佳方案为A1B3C2，对应于试验编号7，而从菌丝体干重来看，也是7号试验的菌丝体干重最重，为7.32 g/L。因此通过正交试验得出，泰山灰树花液体菌种在转速120 r/min，接种量20 mL，温度为24℃的条件下培养，效果最佳，培养10天后的菌丝体干重为7.32 g/L。

表7 泰山灰树花液体菌种培养条件正交试验结果Table7 The results of cultivation conditions for Taishan Grifola frondosa liquid spawn by orthogonal test

3 结论

本试验主要针对泰山灰树花母种和液体菌种的培养条件进行了研究。通过单因素试验，确定了泰山灰树花母种的最适碳源为葡萄糖，最适氮源为酵母膏，适合的添加物为栗树木屑，培养的最适酸碱度为pH 6.0，培养的最适温度为24℃。通过对转速、接种量和温度三因素进行正交试验，确定了泰山灰树花液体菌种的最佳培养条件为：转速120 r/min，接种量20 mL，温度24℃。在此条件下培养出的泰山灰树花液体菌种表现出分散性好、菌丝生长旺盛、菌龄一致等特点。以上试验数据对于泰山灰树花的人工栽培和推广具有重要的参考价值。