人工培育蝉花孢梗束分级多糖的抗氧化活性及对果蝇寿命的影响

邵颖，陈安徽，赵节昌，陈尚龙，巫永华，任格，孙颖

（1.徐州工程学院食品（生物）工程学院，江苏徐州221111；2.江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏徐州221111）

蝉花是虫草属半知菌类或有丝分裂孢子真菌，是具有保健功能的大型药食两用真菌，是我国传统的名贵中药[1-2]。现代药理学研究表明，蝉花中富含多糖、核苷、虫草酸、麦角甾醇、多球壳菌素等活性成分[3-7]，具有增强免疫、抗癌、抗疲劳、解热镇痛、镇静催眠、改善肾脏功能、抗衰老等多种药理功能[8-13]。何晓波等[14]发现金蝉花总多糖能显著刺激Con A和LPS诱导的小鼠淋巴细胞增殖，并促进LPS诱导的小鼠淋巴细胞IgG抗体的生成；陈柏坤等[15]利用体外实验发现了蝉花孢梗束多糖具有抑制白血病细胞株U937、K562增殖的效果；另有学者发现蝉花孢梗束多糖对大鼠细胞具有免疫调节作用[16-18]。于士军等[19]还发现蝉花孢梗束粗多糖具有特定的抗氧化及延缓果蝇衰老的功效。蝉花多糖作为蝉花的主要活性成分，且因其在抗癌防衰、调节机体免疫等方面的作用已成为医药、食品等领域研究和关注的焦点。

虽然广大学者在关于蝉花孢梗束粗多糖的生物活性研究中作了广泛的工作，但是有关蝉花孢梗束分级多糖抗氧化及延寿抗衰活性的系统研究尚未见报道。本研究利用水提醇沉法对蝉花孢梗束进行分级醇沉，并对分级醇沉多糖进行系统的体外抗氧化活性检；以黑腹果蝇为受试对象研究了蝉花孢梗束分级多糖对果蝇寿命及体内超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的影响，以期为蝉花在保健食品、保健品、药品等领域的开发应用提供试验证据和理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

蝉花孢梗束：徐州工程学院食品（生物）工程学院发酵工程实验室自行栽培。

1.1.2 仪器设备和试剂

TUMEN TL-15高速离心机：吉林图们离心机厂；梅特勒AE200型电子天平：上海分析仪器厂；SENCO R-502B型旋转蒸发器：上海申胜生物技术公司；HH-4数显式电热恒温水浴锅：国华电器有限公司；LGJ-10真空冷冻干燥机：上海比朗仪器有限公司；MDF594超低温冰箱：日本SANYO电子有限公司；101-1ES电热鼓风干燥箱：北京市永光明医疗仪器厂。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：美国 sigma公司；95%乙醇、无水乙醇：徐州师范大学科技开发总公司化工厂；菲啰嗪（Ferrozine）：上海市源叶生物科技有限公司；乙二胺四乙酸钠：天津市鼎盛鑫化工有限公司；铁氰化钾：上海生工生物试剂有限公司；苯酚、浓硫酸、三氯甲烷：无锡市亚盛化工有限公司；考马斯亮蓝：天津市福晨化学试剂厂；SOD试剂盒、MDA试剂盒：南京建成生物工程公司。

1.2 研究方法

1.2.1 蝉花孢梗束分级多糖的提取

蝉花孢梗束粉碎过40目筛，以料液比1∶20（g/mL）的比例加入蒸馏水于90℃恒温水浴锅内水浴浸提2 h，4 000 r/min离心10 min收集上清液，残渣再按照上述方法浸提1次，收集两次浸提的上清液并减压浓缩至原浸提液总体积的1/5左右备用。

向上述浓缩后的浸提液中加入95%的乙醇，并调整溶液中乙醇终浓度至20%，溶液置于4℃冰箱静置24小时后于4 000 r/min离心10 min，收集上清液和沉淀。沉淀使用乙醚和丙酮洗涤3次后冷冻干燥得到20%分级多糖样品，样品标记为P20并于4℃冰箱保存备用。上清液中继续加入95%乙醇，调整上清液中乙醇终浓度逐渐分别达到30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，并于4℃冰箱静置24小时后于4 000 r/min离心10 min，沉淀使用乙醚和丙酮洗涤3次后冷冻干燥分别得到30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%分级多糖样品，分别标记为P30、P40、P50、P60、P70、P80、P90，各分级多糖于 4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 蝉花孢梗束分级多糖体外抗氧化活性测定

1.2.2.1 还原力的测定

将分级多糖样品配制成1.5 g/L的多糖溶液并按梯度稀释至不同的质量浓度（0.02 g/L～1.5 g/L）。量取不同质量浓度的样液2 mL，分别加入0.2 mol/L pH6.6的磷酸缓冲液2 mL，再加入1%的铁氰化钾溶液2 mL，振荡摇匀，然后于50℃水浴20 min后加入2 mL 10%的三氯乙酸溶液，混匀后以3 000 r/min离心10 min。离心后吸取2 mL上清液，再加2 mL去离子水和0.4 mL 0.1%的FeCl3溶液，振荡摇匀后再于50℃条件水浴保温10 min，当体系溶液的颜色由黄色变成蓝色时，于700 nm测定其吸光值A700，还原能力则随样品吸光度的增大而增强。空白对照使用蒸馏水代替样品，稀释至不同质量浓度（0.02 g/L～0.1 g/L）的VC作为阳性对照。

1.2.2.2 DPPH自由基清除活性测定

将分级多糖样品配制成1 g/L的多糖溶液并按梯度稀释至不同的质量浓度（0.01 g/L～1 g/L）。分别量取各样品溶液1.5 mL，加入0.2 mmol/L DPPH的95%乙醇溶液1.5 mL，充分混匀，在室温下避光静置30 min，并测定517 nm处的吸光值。以稀释成不同质量浓度（0.01 g/L～0.5 g/L）的 VC作阳性对照。

DPPH自由基清除率计算公式如下：

式中：Ac为对照组吸光度，1.5 mL蒸馏水加1.5 mL 0.2 mmol/L DPPH的95%乙醇溶液；Ai为样品组吸光度，1.5 mL样品液加1.5 mL 0.2 mmol/L DPPH的95%乙醇溶液；Aj为空白组吸光度，1.5 mL样品液加1.5 mL 95%乙醇。

1.2.2.3 铁离子螯合能力测定

各分级多糖配制成8 g/L的多糖溶液并按梯度稀释至不同的质量浓度（0.5 g/L～8 g/L）。量取不同质量浓度（0.5 g/L～8 g/L）的样品溶液 2 mL，加入 2 mmol/L 的氯化亚铁溶液0.1 mL，然后再加入2 mmol/L菲咯嗪（Ferrozine）0.2 mL，混匀后在室温下静置10 min，最后加入等体积的去离子水并于562 nm测定吸光度。以去离子水作空白调零。吸光度越低则表明铁离子鳌合能力越强。以去离子水代替样品作为空白对照，以稀释至不同质量浓度（0.1 g/L～3 g/L）的EDTA作为阳性对照。

按照下列公式计算各分级多糖的铁离子鳌合能力：

式中：A0为空白对照的吸光度；A1为加有样品或者阳性对照后的吸光度。

1.2.3 蝉花孢梗束分级多糖对果蝇寿命的测定

以在基础培养基中按照1%的比例添加不同分级多糖样品饲喂的果蝇为实验组，以不添加多糖仅以基础培养基饲喂的果蝇为对照组（CK）。选取8 h内孵化的果蝇，乙醚麻醉并鉴定性别后选取大小均一的个体于斜面试管中进行饲喂，每只试管放10只果蝇，每个样品雌雄果蝇各设置3个重复。将各组果蝇置于25℃恒温培养箱中培养，每日观察并记录果蝇的存活情况，统计果蝇半数死亡时间、最高寿命和平均寿命。

1.2.4 蝉花孢梗束分级多糖对果蝇体内SOD活性和MDA含量的影响

1.2.4.1 果蝇组织匀浆的制备

参照张明等[20]的方法进行。

1.2.4.2 果蝇组织中可溶性蛋白含量的测定

采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。取1%果蝇组织匀浆液经适当稀释后于595 nm测定吸光值，每组设置3个重复，根据标准蛋白回归方程计算蛋白质含量。标准蛋白质标准曲线回归方程为y=0.000 5x+0.025 2，R2=0.990 7。

1.2.4.3 果蝇体内超氧化物歧化酶（SOD）活力的测定

按照试剂盒使用说明操作。取50 μL果蝇组织匀浆测定SOD活力，每组设置3个重复。按照下列公式计算SOD活力。

1.2.4.4 果蝇体内丙二醛（MDA）含量的测定

按照试剂盒使用说明操作。取100 μL果蝇组织匀浆测定MDA含量，每组设置3个重复。按照下列公式计算MDA含量。

1.2.5 数据统计分析

数据采用DPS7.05处理软件进行分析，结果采用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 蝉花孢梗束分级多糖的体外抗氧化活性

2.1.1 蝉花孢梗束分级多糖的还原力

还原力是检测蝉花孢梗束分级多糖抗氧化能力的重要指标，可以根据吸光度的变化直观地反映抗氧化能力的大小。根据1.2.2.1的方法测定了各分级多糖样品的还原能力，具体结果如图1所示。

图1 蝉花孢梗束分级多糖样品的还原力Fig.1 Reducing power of rating polysaccharides from fruiting body of Cordyceps cicade

由图1可知，除P50外，蝉花孢梗束其他分级多糖的还原能力随着多糖质量浓度的增加而增加。P50样品在0.1 mg/mL～0.5 mg/mL浓度范围时吸光度增长明显，但是随着多糖样品浓度的增长其吸光度却显著降低。在质量浓度0.5 mg/mL～1.5 mg/mL范围内，P60、P30和P70均表现出了较好的还原能力，在质量浓度为1.5 mg/mL时，P60样品的吸光值达到了1.053 3。蝉花孢梗束分级多糖样品的还原能力虽不及阳性对照VC，但都显示了还原能力。

2.1.2 蝉花孢梗束分级多糖的DPPH自由基清除能力

根据1.2.2.2的方法测定了蝉花孢梗束各分级多糖的DPPH自由基清除活性，具体的结果如图2所示。

由图2可知，蝉花孢梗束各分级多糖样品均具有DPPH自由基清除活性，但效果没有阳性对照VC明显。随着分级多糖样品质量浓度的增加，除P30样品外其他样品的自由基清除活性均呈增强趋势，呈现出一定的剂量效应关系。P30样品在质量浓度低于0.6 mg/mL时自由基清除率随样品浓度的增加而升高，但超过该浓度DPPH自由基清除活性反而明显降低了。从图中可看出，P60、P40和P70多糖样品的自由基清除活性较好，其EC50值分别为0.326、0.278、0.385 mg/mL。

2.1.3 蝉花孢梗束分级多糖的铁离子螯合能力

铁离子是人体内必需的微量元素，但也会引起脂质过氧化而产生相应的自由基，所以铁离子螯合率被看作是一种重要的抗氧化指标。根据1.2.2.3的方法对蝉花孢梗束分级多糖样品的铁离子螯合能力进行了测定，具体结果由图3所示。

图2 蝉花孢梗束分级多糖对DPPH自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effects of rating polysaccharides from fruiting body of Cordyceps cicade on DPPH radicals

图3 蝉花孢梗束分级多糖的铁离子螯合能力Fig.3 Chelating ability of rating polysaccharides from fruiting body of Cordyceps cicade on ferrous ions

由图3可知，蝉花孢梗束分级多糖样品的铁离子螯合率均随样品浓度的增加而增加。所有样品中P60的铁离子螯合能力最为突出，在其浓度为2 mg/mL时铁离子螯合率已达到（59.8±3.12）%，而且随着样品浓度的增加其螯合率仍呈现上升趋势。其次，P70和P80多糖样品的铁离子螯合能力也较好，在浓度为6 mg/mL时，两样品的铁离子螯合率分别为（60.12±4.36）%和（58.77±1.32）%。虽然各多糖样品均显示了铁离子的螯合能力，但是螯合能力没有阳性对照EDTA强。

2.2 蝉花孢梗束分级多糖对果蝇寿命的影响

将蝉花孢梗束分级多糖按照1%的比例添加到果蝇基础培养基，仅以基础培养基饲喂的果蝇为对照考察了蝉花孢梗束分级多糖对果蝇寿命的影响。具体结果如表1所示。

由表1可知，各试验组果蝇平均寿命虽然在数值上高于对照组但未达到显著水平。与对照组相比，P60和P70多糖样品显著提高了雄性果蝇的半数死亡时间和最高寿命（p<0.05），半数死亡时间分别比对照组提高了15.19%和7.60%；最高寿命分别比对照组提高了20.32%和18.71%。对于雌果蝇来说，分级多糖P50、P60试验组的半数死亡时间显著高于对照组（p<0.05），比对照组分别提高了7.02%和9.00%；P50、P60和P80则显著提高了雌果蝇的最高寿命，分别比对照组提高了16.68%、25%和16.68%。说明蝉花孢梗束的部分分级多糖具有延长果蝇寿命的作用，综合比较各分级多糖对果蝇寿命的影响发现分级多糖P60的延寿效果最为显著。

表1 蝉花孢梗束分级多糖对果蝇寿命的影响Table1 The effect of rating polysaccharides of fruiting body of Cordyceps Cicade on lifespan of Drosophila Melanogaster

2.3 蝉花孢梗束分级多糖对果蝇SOD活性及MDA含量的影响

将蝉花孢梗束分级多糖按照1%的比例添加到果蝇基础培养基饲喂果蝇20 d，以仅饲喂基础培养基的果蝇为对照，考察了蝉花孢梗束分级多糖对果蝇SOD活性及MDA含量的影响。具体结果如表2所示。

表2 蝉花孢梗束分级多糖对果蝇SOD活性及MDA含量的影响Table2 The effect of rating polysaccharides of fruiting body of Cordyceps Cicadae on activity of SOD and content of MDA in Drosophila Melanogaster

由表2可知，分级多糖P60、P70显著提高了雄性果蝇体内的SOD活力（p<0.05），比对照组分别提高了23.58%和18.90%，P60多糖组雌性果蝇体内的SOD活力与对照组相比提高了28.21%且与其他组间的差异达到了显著水平（p<0.05）。在降低果蝇体内MDA含量方面，P70和P90分级多糖对雄性果蝇的效果最好，其次是P60和P30；雌性果蝇各组间体内MDA含量均无显著性差异，但P60组果蝇体内的MDA含量最低。说明蝉花孢梗束分级多糖能够提高果蝇体内SOD活力和降低MDA含量，其中P60分级多糖的综合效果最好。

3 结论

中医认为蝉花是一种功效与冬虫夏草近似的珍贵中药材，文献记载蝉花味甘、性寒、具疏散风热、定惊解痉之功效[21]。蝉花孢梗束即蝉花子实体，蝉花多糖作为蝉花的一种主要活性成分已成为诸多研究者的研究热点。

本研究采用DPPH自由基清除活性、还原力和铁离子螯合能力分析了蝉花孢梗束分级多糖的体外抗氧化活性，发现各分级多糖均具有体外抗氧化活性，自由基清除能力分别为P40＞P60＞P70，分级多糖P60、P70、P30 的还原能力较其他多糖强，P60、P70、P80 铁离子的螯合能力较强；至于分级多糖对果蝇寿命和体内SOD活力、MDA含量的影响，P60分级多糖可显著提高雌雄果蝇的平均寿命、半数死亡时间、最高寿命（p＜0.05）及果蝇体内 SOD 酶的活力（p＜0.05），P70、P90分级多糖显著降低了雄果蝇体内MDA的含量（p＜0.05），除P70和P90外P60多糖的效果也较好，各分级多糖对雌果蝇体内MDA含量的影响差异虽不显著但均低于空白对照组。综合评价各分级多糖的功效，P60分级多糖的体外抗氧化活性及对果蝇寿命及抗衰的效果最为突出。各分级多糖在体外抗氧化活性及延寿抗衰功效方面的表现为蝉花孢梗束多糖在抗衰、延寿类功能食品、保健品甚至化妆品等领域的应用提供了试验证据，至于蝉花孢梗束延寿抗衰功效多糖的进一步分离纯化及机理研究值得做深入探讨。