响应面优化超声辅助提取鸡桑叶多糖工艺

洪璇，陈仲巍，李鹤宾，杨丙晔，罗浩虹，林启凰

（厦门医学院厦门市海洋医用天然产物与细胞工程重点实验室，福建厦门361023）

鸡桑（Morus australis）是桑科，桑属小乔木或灌木，在我国的大部分省份均有分布，鸡桑在我国具有数千年的种植历史，是一种重要的经济作物[1]。鸡桑营养丰富，含有人体必需的生物碱、维生素、氨基酸、多糖和黄酮等多种天然有效成分，具有抗炎、抗肿瘤、抗衰老、降血压、降血糖、降血脂等多种生理功能[2-3]。其中多糖是自然界中动植物等生物体内具有某种特殊生物学功能的高分子碳水化合物，具有预防动脉硬化、延缓衰老、抗肿瘤﹑抗炎、抗氧化等多种生理活性[4-5]。但由于对鸡桑研究及加工技术的缺乏，经济价值一直没有得到充分的体现。本文对鸡桑叶多糖进行提取，并对提取工艺进行了优化，为进一步开发鸡桑叶为天然食品抗氧化剂和天然药物提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸡桑叶：采于厦门市同安区五显镇；乙醇（食用级）：浙江共辉食品科技有限公司；其它试剂均为分析纯。

UV-1800PC-DS2型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司生产的；KQ-100DE型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 提取工艺

将采摘的鸡桑叶浸泡于蒸馏水，洗净，自然晾干，并于50℃的鼓风干燥箱中干燥，粉碎，取60目～80目的粉末，备用。称取一定量备用的鸡桑叶，加入无水乙醇进行浸泡，过滤，得滤渣，将石油醚加入到滤渣中进行脱脂脱色，过滤并干燥得滤渣。将滤渣加入到烧瓶中，按照所考察的因素及条件进行回流。操作工艺结束后，加入Sevag试剂进行震荡，静置分液除去有机层，后过滤得滤液，将滤液进行浓缩后在容量并中定容。

1.2.2 多糖含量的测定

按文献[6]方法对定容后的鸡桑叶提取液进行多糖含量的测定，并计算出鸡桑叶多糖的提取率：

其中：b为鸡桑叶多糖质量浓度，mg/mL；V为提取液定容后的体积，mL；m为鸡桑叶质量，g。

1.2.3 单因素试验

在其它条件固定的条件下，固定超声功率80 W、超声时间25 min、超声温度75℃和液料比20∶1（mL/g），考察超声功率（60、70、80、90 W 和 100 W）、超声时间（15、20、25、30 min 和 35 min）、超声温度（65、70、75、80℃和85℃）和液料比[10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g）和30 ∶1（mL/g）]、对鸡桑叶多糖提取率的影响。

1.2.4 响应面设计

根据1.2.3试验的结果进行Box-Behnken试验设计，以鸡桑叶多糖提取率为响应值，以超声功率（A）、超声时间（B）、超声温度（C）和液料比（D）四因素为自变量，进行响应面优化，因子编码及水平如表1所示。

表1 因素与水平编码表Table1 Code table of factors and levels

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 超声功率的影响

超声功率对多糖提取率的影响见图1。

图1 超声功率对多糖提取率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic power on yield of polysaccharides

由图1可知，当超声功率达到80 W时，鸡桑叶多糖提取率达到最大值。这是因为提取系统的空化、剪切等作用会随着超声功率的增大而增强，从而促进了多糖的溶出，而当超声功率过大时，空化等作用太强，溶剂中的某些区域会瞬时升温，部分多糖分子链会断裂而分解[7]。因此超声功率选择为80 W。

2.1.2 超声时间的影响

超声时间对多糖提取率的影响见图2。

图2 超声时间对多糖提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on yield of polysaccharides

由图2可知，当超声时间达到25 min时，鸡桑叶多糖提取率达到最大值。这是因为鸡桑叶颗粒与溶剂的接触与传质时间会随着超声时间的延长而增大，促进多糖的溶出，而当超声时间太长时，长时间的空化和热等作用下，多糖分子链会断裂而分解[8]。因此超声时间选择为25 min。

2.1.3 超声温度的影响

超声温度对多糖提取率的影响见图3。

图3 超声温度对多糖提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on yield of polysaccharides

由图3可知，当超声温度达到75℃时，鸡桑叶多糖提取率达到最大值。这是因为提取系统溶剂与鸡桑叶颗粒的碰撞与传质会随着超声温度的升高而增大，从而使得多糖溶出量增大，而当超声温度过高时，多糖中耐热性较差的部分会发生热分解[9]。因此超声温度选择为75℃。

2.1.4 料液比的影响

液料比对多糖提取率的影响见图4。

图4 液料比对多糖提取率的影响Fig.4 Effect of liquid-material ratio on yield of polysaccharides

由图4可知，当液料比达到20∶1（mL/g）时，鸡桑叶多糖提取率达到最大值，这是因为鸡桑叶颗粒内部多糖与溶剂间的浓度梯度会随着提取体系溶剂量增加而增大，使得多糖更容易溶出，而当液料比过大时，鸡桑叶颗粒中的杂质会与多糖产生溶出竞争[10]。因此液料比选择为 20 ∶1（mL/g）。

2.2 响应面优化鸡桑叶多糖工艺

2.2.1 响应面试验

在2.1单因素试验的基础上，根据Box-Benhnken设计进行试验，以鸡桑叶多糖提取率为响应值，得到试验结果如表2，并进行响应面与方差分析得表3。

表2 Box-Benhnken试验设计及结果Table2 Box-Benhnken design and result

表3 回归模型的分析结果Table3 Analysis results of regression

续表3 回归模型的分析结果Continue table 3 Analysis results of regression

鸡桑叶多糖提取率（Y）与超声功率（A）、超声时间（B）、超声温度（C）和液料比（D）四因素的四元二次回归方程可通过表2的试验数据分析得到：

表3的显著性和方差分析显示，该回归方程极显著（F=24.02，P＜0.000 1）；相关系数 R2=0.960 0，说明有超过96%以上的真实值可以用该模型来反映。失拟项不显著（F=5.56，P=0.056 3＞0.05），说明该模型拟合情况较好，受其它因素影响较小。回归方程中一次项D，交互项AC、AD对鸡桑叶多糖提取率影响不显著（P＞0.05）；一次项A、B对鸡桑叶多糖提取率影响显著（P＜0.05）；一次项 C，交互项 AB、BC、BD、CD，二次项 A2、B2、C2、D2对鸡桑叶多糖提取率影响极显著（P＜0.01），说明鸡桑叶多糖提取率与所考察的超声功率、超声时间、超声温度和液料比等工艺与之间不是简单的线性关系。从方差分析中的F值及P值可知，所考察的4个因素的主次顺序为：超声温度＞超声功率＞超声时间＞液料比。综上分析，说明该响应面模型有效，可靠性好。

2.2.2 交互作用分析

利用Design-Expert 8.05b软件对超声功率、超声时间、超声温度和液料比之间两两交互作用的关系作出响应面及等高线图，如图5所示。通过图中可以得到所考察因素所对应范围内的极大值点，从等高线可以看出各因素的影响程度。

图5 各因素交互作用对多糖提取率的影响Fig.5 Effect of factors interaction on yield of polysaccharide

由图5a可知，超声功率和超声时间对鸡桑叶多糖提取率的交互作用极显著，当超声功率为80 W，超声时间为25 min时，多糖提取率达到最大；从等高线图可知，超声功率对多糖提取率影响比超声时间更为显著。由图5b可知，超声功率和超声温度对鸡桑叶多糖提取率的交互作用不显著，当超声功率为80 W，超声温度为75℃时，多糖提取率达到最大；从等高线图可知，超声温度对多糖提取率影响比超声功率更为显著。由图5c可知，超声功率和液料比对鸡桑叶多糖提取率的交互作用不显著，当超声功率为80 W，液料比为20∶1（mL/g）时，多糖提取率达到最大；从等高线图可知，超声功率对多糖提取率影响比液料比更为显著。由图5d可知，超声时间和超声温度声时间对鸡桑叶多糖提取率的交互作用极显著，当超声时间为25 min，超声温度为75℃时，多糖提取率达到最大；从等高线图可知，超声温度对多糖提取率影响比超声时间更为显著。由图5e可知，超声时间和液料比对鸡桑叶多糖提取率的交互作用极显著，当超声时间为25 min，液料比为20∶1（mL/g）时，多糖提取率达到最大；从等高线图可知，超声时间对多糖提取率影响比液料比更为显著。由图5f可知，超声温度和液料比对鸡桑叶多糖提取率的交互作用极显著，当超声温度为80℃，液料比为25∶1（mL/g）时，多糖提取率达到最大；从等高线图可知，超声温度对多糖提取率影响比液料比更为显著。

2.2.3 验证试验

利用响应面软件对所得的二次回归方程进行分析得到鸡桑叶多糖的最佳提取工艺为超声功率80.23 W、超声时间25.86 min、超声温度73.28℃和液料比18.71∶1（mL/g），在最佳的预测工艺条件下，多糖提取率的最大值为48.41 mg/g。结合试验操作的便利性，将工艺修正为超声功率80 W、超声时间26 min、超声温度73℃和液料比19∶1（mL/g），在修正后的工艺条件下，进行平行试验，得到鸡桑叶多糖的平均提取率为 48.21 mg/g，与预测值相比（48.41 mg/g），其相差为0.41%，说明该响应面模型有效，可靠性好，该研究为鸡桑叶多糖的深度开发提供理论依据。

3 结论

以鸡桑叶为原料，对影响鸡桑叶多糖提取率因素进行考察并进行Box-Behnken设计和响应面优化，获得最佳提取工艺为：超声功率80 W、超声时间26 min、超声温度73℃和液料比19∶1（mL/g）。在该条件下，鸡桑叶多糖的提取率为48.21 mg/g，与预测值相比（48.41 mg/g），其相差为0.41%，说明该响应面模型有效，可靠性好。该研究为鸡桑叶多糖的深度开发提供理论依据。