SOD 的稳定性及修饰的研究

程杨，战虎，庞泉

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；2.天津市食品研究所有限公司，天津301609；3.天津市食品安全检测技术研究院，天津300308）

SOD是超氧化物歧化酶（super oxide dismutase）的英文缩写，又名为肝蛋白，是一种源自生命体的活性物质[1]。SOD属于金属酶范畴，按其结合的金属离子来区分可分为三类：第一类含有铜和锌，称为Cu、Zn-SOD，也是最常见的一种，颜色呈蓝绿色，主要存在于真核生物细胞中。第二类含有锰，故称为Mn-SOD，颜色呈粉红色，主要存在于原核生物和真核生物的线粒体中。第三类含有铁，称为Fe-SOD，颜色呈黄褐色，主要存在于原核生物及某些植物叶绿体中[2]。

由于超氧化物歧化酶广泛存在于各类生物体中，能使生物体内超氧自由基（O2-·）发生歧化反应，成为生物体内O2-·的天然消除剂，可对生物体细胞起到保护作用。因此，SOD在帮助生物体防御O2-·的毒性、抗衰老、消炎甚至预防肿瘤等方面起着重要的生理作用。这使得SOD近年来被广泛应用到日用品，食品，医疗等方面。在我国，关于SOD研究应用的深度和广度已居酶类生化制剂的首位[3-4]。

随着对SOD的深入研究，如今SOD的提取来源也相当丰富，目前比较常见的是从植物中、微生物中、动物源性食品中提取SOD。本研究对木瓜、酵母菌、牛奶中提取到的SOD进行了稳定性考察并对SOD粗提物进行修饰。

1 材料和方法

1.1 材料与主要试剂

新鲜牛奶：天津市海河乳业有限公司；木瓜（湖北常阳产）：市售；酵母菌：天津市啤酒厂；三羟甲基氨基甲烷（Tris）：美国sigma公司；盐酸：天津市风船化学试剂科技有限公司；无水乙醇、磷酸二氢钾：天津市化学试剂一厂；三氯甲烷、异丙醇、丙酮：天津市北方天医化学试剂厂；月桂酸：天津市永大化学试剂有限公司；氯化亚砜：天津市天新精细化工开发中心；小牛血清蛋白：罗氏制药有限公司；戊二醛：中国医药集团；壳聚糖：南凯博化工产品有限公司；甘氨酸：河北华阳生物科技有限公司；邻苯三酚：天津市津东天正精细化学试剂厂，以上试剂均为分析纯；实验用水为二级实验水。

1.2 设备与主要仪器

GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；TU-1810紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；PHS-3C型pH计：上海雷磁仪器厂；FW100高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；AB265-S型电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同原料中SOD的提取工艺

1.3.1.1 牛奶中SOD的提取工艺[5]

新鲜牛奶→加入无水乙醇→一次提取→离心分离→二次提取→离心分离上清液浓缩→冷冻干燥→粗酶液。

1.3.1.2 木瓜中SOD的提取工艺[6]

称取新鲜木瓜→用粉碎机打碎→加入0.1 mol/L pH 7.8的磷酸缓冲液搅拌均匀浸提2 h→离心→向提取液中加入三氯甲烷-氯仿充分混匀→粗酶液。

1.3.1.3 酵母菌中SOD的提取工艺[7]

向酵母泥加入异丙醇浸泡2 h→抽滤出异丙醇→加入50 mmol/L pH 7.0的磷酸钾缓冲液搅拌后静置2 h→离心后除去菌体→用HCl调节pH值→加入丙酮萃取→粗酶液。

1.3.2 SOD酶活力测定方法[8]

A液的配置：pH8.20的0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）-盐酸缓冲溶液（内含 1 mmol/L EDTA·2Na）。称取1.211 4 g Tris和37.2 mg EDTA·2Na溶于62.4 mL 0.1 mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100 mL。

B液的配置：4.5 mmol/L邻苯三酚盐酸溶液。称取邻苯三酚（A.R）56.7 mg溶于少量10 mmol/L盐酸溶液，并定容至100 mL。

称取0.089 6 g（精确到0.000 1 g）修饰后的SOD提取物，将其用蒸馏水稀释至10 mL，在离心机中于4 000 r/min离心。取离心后的上清液1.0 mL用蒸馏水定容到250 mL，备用。

在紫外-可见分光光度计上于320 nm下测定空白试剂1 min后的吸光变化值，记做△A320（min-1）。空白试剂的△A320（min-1）应为0.060左右。本试验测得空白试剂的A320为0.0894，1分钟后的A320为0.1502，则空白试剂的△A320（min-1）为0.060 8，满足试验要求，可继续测定样品。

1.3.3 SOD蛋白的修饰方法

为了增强SOD的稳定性，本研究选择3种不同的修饰剂对所提取的3种SOD进行修饰，通过测定修饰后SOD剩余酶活性来确定修饰率，最终选择出3种SOD合适的修饰方法[8]。修饰剂分别为月桂酸、牛血清白蛋白、壳聚糖。

1.3.3.1 月桂酸修饰SOD方法

在通风橱内安装回流装置，使月桂酸和氯化亚砜在75℃的水浴锅中反应2 h，后在90℃～95℃水浴中反应2 h。将反应物分馏、减压，除去过量的氯化亚砜，收集146℃～150℃馏分物月桂酰氯。

准确称取SOD冻干粉0.5 g，溶于pH8.0的0.002 mol/L磷酸盐缓冲液中。缓慢加入上述馏分物月桂酰氯，同时，加入0.1 mol/L NaOH溶液维持pH值，立即将水浴升温至42℃搅拌1 h，收集。冷却后加入1倍体积的冷丙酮，离心后收集沉淀物并将其溶于适量蒸馏水中，再次离心，取上清液，透析后冻干，即得月桂酸-SOD。

1.3.3.2 牛血清白蛋白修饰SOD方法

准确称取SOD冻干粉0.5g，溶于pH8.0、0.005 mol/L的磷酸缓冲溶液中。称取牛血清白蛋白0.5 g与SOD冻干粉混合均匀，置于冰浴中，缓慢加入25%戊二醛，放置1 h，加入甘氨酸20 mg使反应中止。透析冻干即得牛血清白蛋白修饰SOD。

1.3.3.3 壳聚糖修饰SOD的方法

将0.08 g纳米磁性Fe3O4加入100 mL去离子水中超声，再加入10 mL 0.75 mol/mL的NaOH溶液，充分搅拌；将0.16 g壳聚糖加入到质量分数为1%的醋酸溶液使壳聚糖溶解，再将壳聚糖溶液滴加到上述Fe3O4的NaOH溶液中。

称取0.2 g制备后的壳聚糖，用0.1 mol/L pH 7.8的磷酸盐缓冲液溶胀。将0.1 g的SOD冻干粉和0.2 g溶胀的壳聚糖加入到40 mLpH=7.5磷酸盐缓冲液中，并滴加质量分数为25%的戊二醛0.2 mL，在恒温摇床中于20℃振荡120 min，用磁铁将固定化的SOD沉淀，倾出上清液，即得壳聚糖修饰的SOD[9]。

2 结果与分析

2.1 考察不同原料中提取的SOD的稳定性

对上述3种原料中提取的SOD的稳定性进行了考察，主要考察pH值稳定性、不同温度下的稳定性、外源性试剂稳定性3个方面。

2.1.1 pH值稳定性

将 SOD 酶分别置于 pH3、4.5、6、7.5、9、10.5、12 不同的pH值下，分别于60 min后测定它们的酶活力。pH值稳定性见图1。

图1 3种不同来源SOD的pH值稳定性Fig.1 pH stability of three SOD

通过考察，pH7～8之间时3种SOD活力保存良好，3种SOD蛋白的活力残留率都可以保持在88%以上。当pH值偏酸性时，SOD的活力会随着pH值的升高而开始增加；在碱性pH值范围内时，SOD活力随着碱性的增强而降低，在考察中发现牛奶中提取的SOD的整体活力保存最好，酵母中的SOD活性次之，而木瓜中SOD的整体活力保存最差。

2.1.2 不同温度下SOD的稳定性

将 SOD 酶液分别于 25、37、50、60、80 ℃下保存24 h后，测定它们的酶活力。不同温度下SOD蛋白的稳定性见图2。

图2 三种不同来源SOD蛋白的热稳定性Fig.2 Heat stability of three SOD proteins

通过考察发现，当温度为25℃时3种不同来源的SOD的酶活力均达到最高，随着温度的升高，3种SOD酶的活力开始下降，当温度达到80℃时，3种SOD酶彻底失活。牛奶中提取的SOD酶在温度低于50℃时均表现出较稳定的状态，当温度高于50℃时其酶活性开始大幅度衰减，温度高达80℃时，其中的酶活性基本为零。3种SOD中，牛奶中SOD酶活力保存较好，木瓜中提取的SOD次之，酵母中SOD的活力保持最差。

2.1.3 外源试剂耐受性

SOD酶作为活性物质对于不同试剂的耐受性存在着较大的差异，此次选择SOD提取工艺中常用的67%的甲醇、67%的乙腈提取试剂，以及1 mol/L盐酸胍、3 mol/L尿素和50 mmol/L双氧水等常用缓冲剂作为此次考察的外源试剂。SOD蛋白对外源试剂的耐受性见图3。

图3 三种不同来源SOD的对外源试剂的耐受性Fig.3 Acitivty rate of three SOD

木瓜中SOD对67%甲醇和67%的乙腈的耐受性表现较好，分别为84%和65%，但其对3 mol/L尿素、1 mol/L盐酸胍和50 mmol/L双氧水3种试剂的耐受性较差；此次考察中酵母菌对5种外源试剂的耐受性均在40%以下；而牛奶中的SOD对外源试剂的耐受性表现较好，其SOD的活力均保持在80%左右。根据测试结果显示，牛奶中SOD对5种外源试剂的耐受性明显优于木瓜和酵母菌中提取的SOD。

通过考察不同来源SOD蛋白在上述条件下的稳定性，得出结论：牛奶中的SOD蛋白在不同pH值、不同温度及对外源性试剂的干扰方面的稳定性较为理想。故选择牛奶作为提取原料进行试验，并对从其中提取的SOD做进一步修饰，提高其稳定性。

2.2 SOD酶活力的测定结果

针对牛奶中提取的SOD我们采用经典邻苯三酚自氧化法测定其SOD活性，SOD酶活力的测定采用邻苯三酚自氧化法规定每分钟反应液中SOD抑制邻苯三酚自氧化速率50%时为一个SOD活力单位[10]。

在紫外-可见分光光度计上采用波长扫描程序，在波长200 nm～600 nm范围内对提取物进行扫描，检测邻苯三酚自氧化产物波长吸收规律。利用紫外-可见分光光度计测得的SOD紫外吸收光谱图，见图4。如图4所示，牛奶中SOD的最大吸收波长出现在319 nm处，这与GB/T 5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性测定》[10]中的试验条件320 nm相符，故本试验采用320 nm为试验的测定的波长。

图4 SOD的紫外吸收光谱图Fig.4 UV absorption spectrum of SOD

取数支10 mL离心管，向离心管中加入A液2.35 mL、B液0.15 mL、一定量的蒸馏水及样液，整个试验过程中A液均应恒温于25℃。试验数据及相应的△A320（min-1）值见表1所示。

表1 邻苯三酚自氧化速率测定加样表Table1 Pyrogallot autoxidation rate test volume table

根据上表试验数据显示，当稀释后的酶液加入量为90 μL时，△A320（min-1）的值为0.029 9，近似于50%的自氧化速率空白值，满足试验要求。将酶加入量为90 μL时的相应数值代入公式。根据公式：

式中：A320为邻苯三酚的自氧化速率；A'320为样液抑制邻苯三酚自氧化速率；V1为反应液总体积，本次实验中为4.5 mL；V为加入样液的体积，本次实验中为0.2 mL；D为样液稀释倍数；m为样品质量。

最终计算出样品中SOD酶活性的结果为116 608 U/g。

2.3 3种修饰方法的比较

测定上述3种修饰剂后的SOD吸光值，并计算修饰率。向上述3种修饰酶中加入1 mL 4%NaHCO3，1 mL 10%十二烷基硫酸钠，充分溶解20 min；加入1 mL 0.1%三硝基苯磺酸，在40℃的水浴中保温2 h，用0.5 mL，1 mol/L HCl终止反应，利用紫外-可见分光光度计于350 nm处测定吸光值[11]。修饰结果见表2。

表2 修饰后SOD的剩余酶活力Table2 The left enzyme activity after modification

由表2可以得出，针对牛奶中提取的SOD考察了牛血清白蛋白、月桂酸、壳聚糖对其的修饰作用，月桂酸修饰SOD的得率最高。根据修饰后SOD的剩余活性和修饰率，本研究最终选定利用月桂酸修饰牛奶中提取的SOD。

3 结论

本研究考察了牛奶、木瓜及酵母菌3种不同来源的SOD，通过对它们稳定性的研究，最终确定以新鲜牛奶为原料，用乙醇作为提取试剂，所得SOD的酶活力为116 608 U/g。因SOD具有生物活性，为使其性质稳定，更适合其在各种环境下发挥作用。本研究考察了月桂酸、牛血清白蛋白、壳聚糖3种不同的修饰剂对其的修饰效果，最终确定用月桂酸对牛奶中SOD进行修饰，采用经典的邻苯三酚自氧化法测得修饰后的SOD的酶活力为115 127 U/g。