超微粉碎联合超声辅助法提取荠菜多糖工艺研究

荆云，卢慧娟，薛金涛，李鹏

（新乡医学院药学院，河南新乡453003）

荠菜，又名护生草、清明草、荠荠菜、菱角菜等，为十字花科植物荠Capsella bursa-pastoris（Linn.）Medic.的全草，广泛分布在全国各地，生在田野、路边，是一种药食两用的植物。荠菜入药，味甘、淡，性凉；具有利尿、止血、清热、明目、消积功效[1-2]。荠菜含有黄酮类、有机酸、氨基酸、生物碱、糖类、微量元素等多种具有生物活性的化学成分[3]。大量研究表明，植物多糖具有调节机体免疫功能、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗菌抗病毒等多种生物活性[4]，成为近年来研究热点。也有研究发现，荠菜多糖对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌都有一定的抑制作用[5]，同时可清除羟基自由基，具有较强的抗氧化作用[6]；对荠菜多糖（herba capsellae polysaccharide，HCP）的提取工艺研究也有少量报道，但多是单纯用超声波技术对其进行提取制备[5-8]。本试验采用超微粉碎技术联合超声辅助法对荠菜多糖进行提取工艺研究，并对提取工艺中的颗粒度、超声功率、料液比、超声时间等影响因素进行优化，得到适宜的提取条件，为荠菜多糖的进一步深入研究提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

试验用荠菜样品于2016年3月采自河南省新乡县，经鉴定为十字花科植物荠Capsellabursa-pastoris（L.）Medic.的全草。

1.2 试剂

葡萄糖对照品：中国药品生物制品检定所；95%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、浓硫酸（均为分析纯）：洛阳市化学试剂厂；蒸馏水：药学综合实验室自制。

1.3 主要仪器

722S型可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；NLD-6A型超微粉碎机：济南纳力德超微粉碎技术有限公司；DK-98-1型电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；KQ-500DE超声波清洗器：昆山舒美超声仪器有限公司；80-2离心沉淀机：江苏丹阳市兴福五金电器厂；FA2104型电子天平：上海浦春计量仪器有限公司；101-3型电热鼓风恒温干燥箱：江苏金坛市佳美仪器有限公司。

2 试验方法

2.1 样品制备

取生鲜荠菜，流水清洗干净，放入烘箱60℃烘干，将干燥的荠菜放入普通粉碎机粉碎，得到荠菜粗粉；粗粉碎的荠菜经超微粉碎机粉碎后，得到荠菜超微粉。

2.2 荠菜多糖的超声提取

称取一定量经过筛分的荠菜粉末，置于500 mL圆底烧瓶中，按预设的料液比、超声时间、超声功率和颗粒度，超声提取两次，过滤，合并两次滤液。将滤液加热浓缩，加入一定量的95%乙醇，于冰箱中静置24 h，离心，得沉淀，沉淀用蒸馏水溶解，再次加入乙醇，离心沉淀，所得沉淀分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤数次，真空干燥后得荠菜多糖粉末。

2.3 不同粉碎工艺对荠菜多糖提取率的影响

以荠菜多糖提取率为指标，分别采用普通粉碎、超微粉碎方法，考察不同粉碎工艺对荠菜多糖提取的影响。

普通粉碎提取工艺：将干燥后的荠菜放入普通粉碎机粉碎，得到荠菜粗粉，过40目筛，按2.2项下工艺提取制备荠菜多糖，计算荠菜多糖的提取率。

超微粉碎提取工艺：粗粉碎的荠菜经过超微粉碎机粉碎后，筛分出其中200目的荠菜微粉，按2.2项下工艺提取制备荠菜多糖，计算荠菜多糖的提取率。

2.4 葡萄糖标准曲线的制作[9-10]

采用硫酸-苯酚法，精密称取葡萄糖对照品5.4 mg，置于50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得。精密量取对照品溶液 0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL，分别置具塞试管中，加蒸馏水至2.0 mL，各精密加入新配的5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速精密加入硫酸5.0 mL，摇匀，置沸水浴中加热20 min，取出后置冰水浴中降至室温。进行分光光度法试验，以第1管为空白，在490 nm波长处测定吸收度（Y），以浓度（X）为横坐标，吸收度（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=3.840 5X+0.084 3（r=0.999 4）。表明葡萄糖浓度在64.6 μg/mL～173.6 μg/mL范围内线性关系良好。

2.5 荠菜多糖含量测定及多糖提取率的计算

精密称取干燥至恒重的荠菜多糖粉末样品，用蒸馏水稀释一定倍数定容，作为待测溶液，取待测溶液1.0 mL，置于10 mL的具塞试管中，加蒸馏水至2.0 mL，再加入新配的5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速精密加入硫酸5.0 mL，摇匀，置沸水浴中加热20 min，取出后置冰水浴中降至室温。以葡萄糖为标样，于波长490 nm处测定吸光度值，用标准曲线计算出红花多糖的含量，再按照公式：多糖提取率/%=（多糖质量/原料质量）×100，计算荠菜多糖提取率。

3 结果与分析

3.1 不同粉碎工艺制备荠菜多糖提取率比较

分别采用普通粉碎、超微粉碎两种粉碎提取工艺，以荠菜多糖的提取率为指标，考察不同粉碎度对荠菜多糖提取的影响，试验结果见表1。

由表1可知，在两种粉碎粒度中，超微粉碎提取工艺比普通粉碎提取工艺荠菜多糖提取率提高较多，说明超微粉碎有利于荠菜中的多糖提取。因此，可联合超声辅助提取法开展荠菜多糖的提取研究。

表1 2种粉碎工艺提取荠菜多糖提取率比较Table1 Comparison of two kinds of method for extraction ratio of HCP

3.2 单因素试验

分别以料液比、超声时间、颗粒度、超声功率为4个单因素，考察其对荠菜多糖提取率的影响。

3.2.1 料液比对荠菜多糖提取率的影响

取过150目筛的荠菜干粉、在超声时间40 min、超声功率300 W条件下，考察不同料液比1∶10、1∶15、1 ∶20、1∶25、1∶30（g/mL）对荠菜多糖提取率的影响。以多糖提取率为纵坐标、料液比为横坐标制图，见图1。

图1 料液比对荠菜多糖提取率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extration ratio of HCP

结果表明，在料液比低于 1∶25（g/mL）时，随料液比的增加，多糖提取率迅速增加；当料液比大于1∶25（g/mL）后，多糖提取率增加缓慢。由于提取液在后续工艺中须经加热浓缩，加水量过大会造成后续浓缩耗能、耗时、效率降低。故选择料液比1∶25（g/mL）较为合适。

3.2.2 超声时间对荠菜多糖提取率的影响

取过150目筛的荠菜干粉、在料液比1∶25（g/mL）、超声功率300 W条件下，考察不同的超声时间30、35、40、45、50 min对多糖提取率的影响，以多糖提取率为纵坐标、超声时间为横坐标制图，见图2。

图2 超声时间对荠菜多糖提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on the extration ratio of HCP

结果表明，随着超声时间的延长多糖提取率有逐渐增加的趋势，但超过45min后多糖提取率不再增加反而有降低的趋势，可见延长超声时间并不能提高多糖的提取率，因此初步确定超声时间应控制在45min合适。

3.2.3 颗粒度对荠菜多糖提取率的影响

在料液比 1 ∶25（g/mL）、超声时间 45 min、超声功率300 W条件下，荠菜干粉颗粒度分别为80、150、200、300、400目，测定多糖提取率，以多糖提取率为纵坐标、颗粒度为横坐标制图，见图3。

图3 不同颗粒度对荠菜多糖提取率的影响Fig.3 Effect of granularity on the extration ratio of HCP

结果表明，随着颗粒度目数的增加，荠菜干粉越来越细，多糖提取率也逐步上升，这是由于，经过超微粉碎后，植物细胞壁大部分被破坏，而且，超微粉体粒径小，比表面积增大，物料和提取液能够充分接触，有利于多糖的溶出。

3.2.4 超声功率对荠菜多糖提取率的影响

在料液比 1 ∶25（g/mL）、超声时间 45 min、颗粒度300目条件下，考察不同超声功率 100、200、300、400、500 W对多糖提取率的影响，以多糖提取率为纵坐标、超声功率为横坐标制图，见图4。

图4 超声功率对荠菜多糖提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on the extration ratio of HCP

结果表明，超声功率在100 W～300 W之间，多糖提取率上升较快，在300 W之后上升不明显，曲线趋于平缓并有所下降，可能是高功率的超声波破坏了多糖的结构，导致提取率下降。因此，选择超声功率300 W较为合适。

3.3 荠菜多糖提取工艺的优化

在单因素试验的基础上，选择颗粒度、超声时间、料液比、超声功率4项作为考察因素，各取3个水平，进行L9（34）正交试验设计，以多糖提取率为评价指标，考察各因素对提取工艺的影响，以确定超微粉碎联合超声法提取荠菜多糖的最优工艺条件。

因素水平见表2，试验结果见表3，方差分析见表4。

表2 正交试验因素水平表Table2 Factors and levels of orthogonal test

表3 L9（34）正交试验设计及结果Table3Design and results of L9（34）orthogonal test

表4 方差分析Table4 Analysis of variance

由直观分析可以看出，影响提取效果的因素顺序为：超声功率＞颗粒度＞料液比＞超声时间，以因素D影响最大，并且 D3＞D2＞D1，B 因素影响最小，故将其定为误差项进行方差分析。方差分析见表3，方差分析表明，颗粒度、超声功率对提取效果有显著性影响（P＜0.05），料液比、超声时间对提取效果无显著性影响。结合生产实际，考虑到节省工时、降低成本等因素，将最佳提取工艺确定为A2B1C1D3，即颗粒度为300目，料液比 1 ∶20（g/mL），提取时间 40 min，超声功率 500 W。

3.4 工艺验证

按正交试验所得最佳工艺条件（颗粒度300目，料液比 1 ∶20（g/mL），提取时间 40 min，超声功率 500 W）验证3次，结果见表5。

表5 正交试验验证Table5 Validation of orthogonal test

结果表明，验证试验结果与正交试验结果一致，多糖提取率可达到10.98%，该提取工艺条件基本稳定。

4 讨论

植物多糖广泛地存在于植物体内，是植物体内极其重要的生物大分子，并且没有细胞毒性，植物多糖的提取方法较多，主要有溶剂浸渍提取、生物酶溶解提取、超声辅助提取、微波辅助提取、超临界流体萃取等方法[4]。荠菜作为药食两用植物，在民间有着悠久的使用历史；而且，我国荠菜资源丰富，把其作为药用或保健品进行深入研究开发有着极大优势。

超微粉碎技术是近几十年来迅速发展起来的一项高新技术，主要是利用机械设备对物料进行研磨和撞击，克服物料内部凝聚力，将其粉碎至微米级[11]。与普通粉碎技术相比，超微粉碎技术具有细胞破壁率高、粉体粒径细、粒径分布均匀、对物料的活性和营养成分破坏小、能提高原料的利用率等优点[12]；因此，超微粉碎技术在食品以及中医药行业的应用非常广泛。超声提取技术是利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，从而使药物的有效成分较快进入溶剂的一种提取方法[13]。

荠菜的传统应用多以水煎为主，本文采用水为提取溶剂，用超微粉碎技术联合超声辅助法对荠菜多糖进行提取工艺研究。通过使用不同粉碎工艺提取制备荠菜多糖，得出超微粉碎提取工艺比普通粉碎提取工艺荠菜多糖提取率提高较多；可能是荠菜经过超微粉碎后，细胞壁破碎，粒度变得更细小均匀，增加了药材的比表面积，有利于多糖的溶出，增加了提取率。然后采用单因素试验和正交试验相结合，考察影响荠菜多糖提取的各因素，确定了影响荠菜多糖提取率的因素顺序：提取超声功率＞颗粒度＞料液比＞提取时间，确定超微粉碎联合超声辅助提取荠菜多糖的最佳工艺为：颗粒度为 300目，料液比 1∶20（g/mL），提取时间40 min，超声功率500 W。并做了工艺验证，在此工艺条件下，荠菜多糖的提取率为10.98%，且能保持稳定的提取率。

本试验表明，超微粉碎技术联合超声辅助提取方法在植物多糖提取方面有一定的优势，为荠菜多糖的提取及进一步开发利用提供一定的理论依据；同时对全草类药材的多糖提取有较大的借鉴意义。