UPLC-MS/MS法测定对乙酰氨基酚栓的含量

蒋志涛，吕玲燕，王 雪，陈晓峰，余 辉，邢国良

(南京中医药大学附属张家港医院，江苏省企业研究生工作站，张家港 215600)

对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)又称为扑热息痛，化学名为N-(4-羟基苯基)乙酰胺，分子式为C8H9NO2，由对硝基酚钠经还原成对氨基酚，再酰化制得，是大多数解热镇痛药中的主要成分[1-3]。对乙酰氨基酚栓呈乳白色至微黄色，具有解热镇痛的作用，多用于感冒引起的发热、神经痛、偏头痛、头痛、关节痛、痛经、癌痛及手术后止痛等[4-5]。近年来越来越多的研究报道，过量使用对乙酰氨基酚会造成严重的不良反应，如引起人们较多关注的肝毒性[6-9]，随着我国肝脏疾病发生率的逐年增高，过量使用APAP会加重肝脏负担，造成不同程度的肝损伤，为了减少该事件的发生率，对含有APAP的药物进行含量测定显得尤为重要。对乙酰氨基酚栓收录在《中国药典》2015年版二部中，目前对其含量测定多采用紫外-可见分光光度法[10-11]，本文利用UPLC-MS/MS方法，进行对乙酰氨基酚成分的含量测定，并简单评估该药品的质量。此分析方法快速、省时、准确度高、精密度好、灵敏度高，有利于更好地控制产品质量，为用药安全提供保证。

1 仪器与试药

1.1仪器 ACQUITY型超高效液相系统(美国Waters公司，包括自动进样器、四元泵溶剂系统、在线脱气机，Xevo TQ检测器以及MassLynxTM 质谱工作站软件)；AE240电子天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；Drict-Q5超纯水机(法国Millipore公司)；SCQ-250超声波清洗器(上海盛普机械制造有限公司)。

1.2试药 对乙酰氨基酚对照品，质量分数≥99%(批号SJ0711GA14)，购自上海源叶生物科技有限公司。对乙酰氨基酚栓购自湖北成田制药股份有限公司(批号：161002，170204，170509)，规格为0.15 g。实验用水为超纯水；流动相用甲醇为色谱纯(德国Merck公司)；乙酸铵,分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；乙酸，分析纯，购自南京化学试剂股份有限公司。

2 方法与结果

2.1色谱及质谱条件 色谱柱：ACQUITYTMUPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流动相：甲醇-5 mmol·L-1乙酸铵(含2 mL·L-1乙酸)(65∶35)；流速：0.2 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：2 μL。离子源：ESI；离子化模式：正离子检测模式；定量模式：多反应监测模式(MRM)，对乙酰氨基酚m/z152→110，锥孔电压：55 V，碰撞能量：35 V。检测电压:3.5 kV；离子源温度：120 ℃；脱溶剂气流量：500 L·h-1；脱溶剂气温度：350 ℃。

2.2溶液的配制

2.2.1对照品溶液 精密称取对乙酰氨基酚对照品10 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为1.128 mg·mL-1的对照品储备液。精密量取上述储备液1 mL，置于50 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液，将对照品溶液置于4 ℃条件下保存，待用。

2.2.2供试品溶液 取本品10粒，切成小片，精密称取适量(相当于对乙酰氨基酚150 mg)，置于100 mL量瓶中，加入适量甲醇超声处理30 min使其充分溶解，自然冷却后用甲醇定容，摇匀，滤过，精密吸取续滤液100 μL，置于100 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3专属性实验 取2.2项下制备的对照品溶液和供试品溶液各2 μL，注入液相色谱仪，按照2.1项下色谱及质谱条件，所测对乙酰氨基酚的MRM色谱图见图1。结果表明，对照品溶液和供试品溶液在相应位置出峰，且在对乙酰氨基酚保留时间处无干扰色谱峰，所选择的分析方法专属性好。

2.4线性关系、检测限(LOD)和定量限(LOQ)考察 精密量取2.2.1项下制备的对照品储备液适量，用甲醇稀释成质量浓度分别为5.8，58，290，1 550，2 900和5 800 ng·mL-1的系列对照品溶液，分别进样2 μL，按照2.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积。以对乙酰氨基酚对照品的质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)进行线性回归，得回归方程y=90.034x+18 260，r=0.995 7，结果表明，对乙酰氨基酚质量浓度在 5.8～5 800 ng·mL-1范围内，呈良好的线性关系。以信噪比S/N=10时对照品质量浓度作为定量限(LOQ)，对乙酰氨基酚的定量限为5.8 ng·mL-1。考察结果显示，对照品溶液线性关系良好，仪器检测灵敏度高，适合对乙酰氨基酚栓的定量分析。

2.5精密度考察 精密量取2.4项下制备的质量浓度分别为58，1 550和5 800 ng·mL-1的对乙酰氨基酚对照品溶液，分别作为低、中、高质量浓度水平，按照2.1项下色谱条件进样分析，分别于1 d内和连续3 d内测定，重复进样6次，记录峰面积，考察日内和日间精密度，结果表明，日内精密度的RSD值均小于2.1%，日间精密度的RSD值均小于2.6% (n=6)，结果表明该方法精密度良好，符合实验要求。

图1MRM色谱图

A.对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.对乙酰氨基酚。

Fig.1 MRM chromatograms

A.reference substance；B.samples；C.negative control；1.acetaminophen.

2.6重复性实验 取样品(批号170509)6份，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样分析，测得对乙酰氨基酚峰面积的RSD值为 1.7% (n=6)，均符合规定，结果表明，该测定方法的重复性良好。

2.7稳定性实验 取样品(批号170509)适量，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，将供试品溶液置于4 ℃冰箱中保存，按照2.1项下色谱条件分别于放置0，2，4，6，8，10，12和24 h后进样分析，计算得对乙酰氨基酚峰面积的RSD值为1.8% (n=6)，结果表明，被测成分在24 h内基本稳定。

2.8加样回收率实验 精密称取已知含量的对乙酰氨基酚栓样品(批号170509) 6 份，每份相当于对乙酰氨基酚150 mg，置于100 mL量瓶中，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，每份取续滤液1 mL，置于50 mL量瓶中，分别精密加入对乙酰氨基酚对照品储备液0.5 mL，分别取2 μL注入液相色谱仪，按照2.1项下色谱及质谱条件进样分析测定[12-15]，计算对乙酰氨基酚栓的平均回收率为99.2%，RSD值为2.0%，结果表明，该方法回收率良好，准确可靠。见表1。

2.9样品的含量测定 精密称取3个不同批号的对乙酰氨基酚栓样品(批号：161002，170204，170509)，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，分别进样2 μL，按照2.1项下色谱与质谱条件进样分析测定3次，利用已建立的标准曲线，计算3个批号对乙酰氨基酚栓中对乙酰氨基酚的含量，批号161002的栓剂中对乙酰氨基酚的含量分别为100.3%，100.5%和100.4%；批号170204的栓剂中对乙酰氨基酚的含量分别为99.4%，99.7%和99.7%；批号170509的栓剂中对乙酰氨基酚的含量分别为100.1%，100.3%和99.9%。结果3个批号对乙酰氨基酚栓中对乙酰氨基酚标示量的百分含量分别为100.4%，99.6%和100.1% (n=3)。结果表明，该厂所生产的对乙酰氨基酚栓含量符合要求。

表1对乙酰氨基酚栓剂的加样回收率实验结果

Tab.1 Results of recovery test of Paracetamol Suppositories(n=6)

样品含量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%1.500 30.564 02.103 9101.999.22.01.499 90.564 02.021 097.9 1.500 20.564 02.049 599.3 1.500 10.564 02.041 698.9 1.499 70.564 02.081 2100.91.500 30.564 01.991 496.5

3 讨论

3.1检测方法的建立 目前对于对乙酰氨基酚成分的分析多见紫外分光光度法和HPLC法测定报道[16-19]。与文献相比，本实验建立的UPLC-MS/MS分析方法简单可靠、重复性和分离效果好，可在短时间内快速检测出对乙酰氨基酚栓中对乙酰氨基酚的含量，可为该药的质量控制及药品安全提供科学依据，并为对乙酰氨基酚的药代动力学等相关研究提供可靠的含量测定方法。

3.2UPLC-MS/MS条件的确定 实验中比较了不同规格超高效液相色谱柱对色谱分离的影响，结果采用ACQUITYTMUPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)所得色谱峰保留时间适中，峰形较好。在实验过程中同时对流动相进行了考察，分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-5 mmol·L-1乙酸铵、甲醇-5 mmol·L-1乙酸铵(含2 mL·L-1乙酸)和乙腈-5 mmol·L-1乙酸铵，结果表明，甲醇-5 mmol·L-1乙酸铵(含2 mL·L-1乙酸)(65∶35)作为流动相时，对乙酰氨基酚显示较高的检测灵敏度和较好的峰形。实验中还对离子检测模式进行了考察，对对乙酰氨基酚分别进行了正、负离子扫描，结果发现对乙酰氨基酚在正离子模式下响应较好，相应质谱参数通过IntelliStart功能自动扫描确定，所得参数能较好地应用于对乙酰氨基酚的含量测定。

4 小结

UPLC-MS/MS法检测快速，极大地缩短了样品的保留时间，有利于保证样品的稳定性，同时节省了分析时间和节约配制流动相所需的有机试剂，有较好的稳定性和准确性，可提高工作效率。该方法精密度好、灵敏度高，有利于今后进一步分析测定对乙酰氨基酚在血浆中的浓度和进行体内药代动力学的研究。该方法具有高分离、高灵敏度、高选择性以及提供丰富结构信息等优良的性能和操作性，使用广泛，近年来越来越多地应用于药物含量测定，有利于更好地控制药品质量。本实验采用UPLC-MS/MS法同时对3个批号对乙酰氨基酚栓中的有效成分对乙酰氨基酚的含量进行测定，结果显示，各批次中对乙酰氨基酚的含量无明显差异，该方法简单、灵敏度高，为对乙酰氨基酚栓的质量控制提供了有效的检测手段。