重复玻璃化冻融胚胎移植后临床结局

张宏展，熊风，李观贵，孙青，陈培林，万才云，姚志鸿，钟惠娴，曾勇

(深圳中山泌尿外科医院生殖中心，深圳市围着床期生殖免疫重点实验室，深圳中山生殖与遗传研究所，深圳 518045)

胚胎冷冻解冻是人类辅助生殖技术(ART)中的一项重要延伸技术，依靠该技术实现胚胎的长期保存，不仅能够减少ART中药物控制性促排卵的次数，充分利用一次促排卵获得的所有胚胎，提高累积妊娠率；而且还为规避如内膜容受性差、过度刺激风险高等不利移植时机提供可能，提高单次移植妊娠率[1-2]。因此，未移植的可用胚胎冷冻后保存数月或数年后，待适宜时机解冻再移植入母体子宫已经是目前IVF-ET过程中的普遍做法，即胚胎移植前经历一次冷冻、一次解冻过程。在实际的临床工作中，胚胎复苏移植周期中会遇到一些特殊情况如患者突发阴道炎、急性感染、发热等，导致已经复苏的胚胎无法移植入母体子宫，被迫对胚胎进行重复玻璃化冷冻保存，后续再行二次解冻移植。本研究拟探讨重复冷冻胚胎复苏后的存活情况及移植后的临床结局，实现更清楚的患者知情。

资料与方法

一、研究对象

选取2013年1月至2017年9月于本院生殖科行重复玻璃化冷冻胚胎解冻的周期为研究对象，共收集卵裂期胚胎二次解冻周期39个，囊胚二次解冻周期18个。39个卵裂期胚胎解冻周期中，1个周期因胚胎溶解重新解冻其它胚胎移植，4个周期解冻后行囊胚培养未移植，10个周期与一次冻融胚胎混合移植，最终单纯移植重复玻璃化卵裂期胚胎周期数24个。18个囊胚解冻周期中，1个周期因胚胎溶解取消移植，4个周期与一次冻融囊胚混合移植，最终单纯移植重复玻璃化囊胚周期数13个。为了研究重复冻融胚胎移植后的临床结局，本研究采用倾向性评分匹配的方法在同时期本科室单次冻融胚胎移植的患者中，依据女性患者的年龄、移植胚胎数、移植优质胚胎数，按1∶3最近邻匹配法，设定卡钳值为0.03保证匹配结果的优良性，进行倾向性评分匹配，最终分别得到59个卵裂期移植周期和39个囊胚移植周期，作为对照组。对比分析两组间的胚胎种植率、生化妊娠率、临床妊娠率、异位妊娠率、早期流产率、活胎分娩率等临床指标。

二、方法

1.促排卵、受精和胚胎培养：促排卵均采用本科室常规促排方案，优势卵泡≥18 mm时，肌肉注射HCG(默克，德国)，36 h后行阴道B 超穿刺取卵，39 h～41 h后加精受精或ICSI受精，精液优化处理采用不连续密度梯度离心法。受精后放置于37℃，5% CO2、5%O2、90%N2的三气培养箱中培养。

2.胚胎评分与冷冻标准：将Peter卵裂期胚胎评分系统[3]结合本中心实际情况制定出D3卵裂期胚胎的评分标准：1级：卵裂球数目≥7个，碎片数量≤10%；2级：卵裂球数目≥7个，10%<碎片数量≤20%；3级：卵裂球数目≥7个，碎片数量>20%或5≤卵裂球数目<7个，碎片数量≤10%；4级：5≤卵裂球数目<7个，碎片数量>10%或卵裂球数目<5个。根据此评分标准，将1级、2级胚胎定义为优质胚胎，一般仅冷冻优质卵裂期胚胎。对于囊胚而言，根据Gardner评分标准，3期及3期以上且内细胞团和滋养层评分不含C的囊胚。

3.玻璃化冷冻与解冻：胚胎冷冻解冻程序采用玻璃化冷冻-快速解冻法。利用玻璃化冷冻/解冻液(SAGE，美国)和Cryotop冷冻载体(Kitazato，日本)进行卵裂期胚胎冷冻/解冻。冷冻及解冻步骤严格按照说明书执行。重复玻璃化为玻璃化冷冻的胚胎解冻后又再次进行玻璃化冷冻。卵裂期胚胎复苏后卵裂球数目≥冷冻胚胎卵裂球数目一半定义为存活，囊胚复苏后囊胚腔扩张，细胞未坍陷瓦解为存活。

4.内膜准备与胚胎移植：对于月经周期正常且排卵规律的患者采用自然周期方案，即根据阴道超声监测，月经天数≥10 d，优势卵泡直径≥14 mm，子宫内膜达到7～8 mm以上，排卵后D3进行卵裂期胚胎、D5进行囊胚移植。月经周期不正常或排卵不规律的患者采用人工周期方案，即月经D3起口服戊酸雌二醇(补佳乐，拜尔，德国)4 mg/d×5 d，根据内膜情况调整剂量及天数。15 d后B超监测子宫内膜厚度7～8 mm以上时，肌肉注射黄体酮(浙江仙琚制药)60 mg/d至移植日。B超介导下行胚胎移植术。

5.黄体支持及妊娠判断：自移植次日改用黄体酮凝胶(默克，德国)90 mg/d置于阴道，直至取卵后 16 d抽血查β-HCG。移植后30 d，B超下见到妊娠囊及原始心管搏动判为临床妊娠，宫内妊娠则行黄体支持至12周。

6.倾向性评分匹配：SPSS 24.0安装相应的R插件和psmatching 3.spe，在SPSS菜单中成功生成PS Matching模块后，按照黄福强等[4]介绍的方法，依据女方年龄、移植胚胎数、移植优质胚胎数，采用1∶3最近邻匹配法、设定卡钳值为0.03保证匹配结果的优良性，最终获得与实验组协变量均衡的对照组样本。

三、统计学分析

采用SPSS 24.0统计软件进行数据的统计分析，均数比较采用t检验，百分率的差异性分析采用χ2检验，P<0.05定义为差异具有统计学意义。

结 果

一、重复玻璃化冷冻胚胎复苏情况

本研究共收集卵裂期胚胎重复冷冻解冻周期39个，解冻胚胎57枚，存活55枚，复苏存活率为96.49%；囊胚重复冷冻解冻周期18个，复苏胚胎24枚，存活23枚，复苏存活率95.83%。

二、两组患者基本资料比较

实验组卵裂期胚胎移植周期和囊胚移植周期的女方年龄、平均移植胚胎数、平均移植优质胚胎数、内膜准备过程中的黄体转化日子宫内膜厚度分别与对照组卵裂期胚胎和囊胚移植周期相比，基本特征均无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 两组移植患者基本资料比较(-±s)

三、移植后临床结局比较

实验组与对照组相比，无论在卵裂期胚胎移植周期中还是在囊胚移植周期中，两组各项指标均呈现相类似的变化趋势，即实验组胚胎移植后种植率、HCG阳性率、临床妊娠率、异位妊娠率、早期流产率、活胎分娩率等临床结局与对照组的单次冻融胚胎移植后的结局无统计学差异(P>0.05)(表2)。

表2 各组患者移植后临床结局比较[(%)]

注：1部分移植周期截至投稿时尚未到随访日期;21个周期生产结局失访。

讨 论

ART的快速发展，胚胎冷冻解冻技术在辅助生殖中的应用越来越广泛，尤其是玻璃化冷冻方法，自1998 年[5]首次报道成功妊娠以来，在全世界迅速被推广应用。所谓玻璃化是指液态的物质在一定的降温速率下，由液相直接转变成为一种玻璃状的固体状态的过程，内部没有晶体结构。对于保存胚胎的溶液，无冰晶的玻璃化状态，能保持溶液内的分子和离子分布，阻止了冷冻和解冻过程中溶液在液态和晶体形态之间来回转换，从而避免了冰晶形成对胚胎的物理化学损伤，获得更好的冷冻效果[6]。在实际应用中，玻璃化冷冻技术也确实获得良好的效果。大量的文献研究表明，玻璃化技术的应用对胚胎及子代都是相对安全的[7-8]，玻璃化法冷冻胚胎出生儿也日益增多。然而，毕竟玻璃化冷冻方法是一种非自然状态下胚胎经历的人工体外操作方法，其实施过程中高浓度冷冻保护剂的毒性作用、体外操作可能引起的胚胎细胞物理损伤或功能损伤、潜在的病原微生物污染等问题都可能影响胚胎的种植潜能[9-10]。尤其是对胚胎进行反复冻融，可能对胚胎产生损伤的几率更大，影响移植的种植潜能及移植后的临床结局。

目前已有的对胚胎反复冻融的研究样本主要是在不同发育阶段进行冷冻，如殷宝莉等[11]分析了玻璃化冷冻复苏的第3天卵裂期胚胎培养至囊胚后再行二次冻融移植，结果显示二次冻融囊胚周期与单次冻融囊胚周期相比，临床妊娠率显著下降，据此认为多次冻融可能影响胚胎发育潜能。2006年Sheehan等[12]采用冷冻环(cryoloop)法对小鼠胚胎在2细胞期、4细胞期、8细胞期、囊胚期冷冻，研究结果表明，玻璃化操作并不影响小鼠胚胎发育形成8细胞期及囊胚期，甚至对移植后的种植潜能和新生鼠仔的体重无显著性差异。与上述不同，本研究关注的患者是同一阶段(卵裂期或囊胚期)连续二次冻融，中间几乎未曾经历长时间体外培养发育的过程。为了探讨这种连续二次冻融对胚胎种植及移植后临床结局的影响，本文对2013年1月至2017年9月经历重复冷冻解冻的57个周期(39个囊胚解冻周期和18个卵裂期胚胎解冻周期)进行回顾性分析。结果表明，复苏重复玻璃化卵裂期胚胎57枚，复苏存活率为96.49%；解冻重复玻璃化囊胚24枚，存活率为95.83%。与目前报道的玻璃化冷冻方法的复苏存活率大致相当[13]，鉴于本中心一般仅冷冻优质胚胎，而优质胚胎本身玻璃化冷冻的效果良好[14]，因此，对于经历一次冻融的胚胎再行重复冻融在技术上是可行的。

为了进一步探讨重复冻融胚胎的种植潜能和移植后的临床结局，我们从上述解冻周期中去除混合移植的周期数，最终收集了24个完全移植重复玻璃化冻融卵裂期胚胎和13个完全移植重复玻璃化冻融囊胚周期，同时相应的以同时期条件相当的移植单次冻融胚胎人群作为对照。分析过程中，为了保证两组样本量以及基础资料的均衡，本研究引入了倾向性评分匹配法[15]，倾向性评分法相当于一个事后随机化的过程，其优势在于能够将不同组间倾向性评分相近的个体匹配出来，均衡组间混杂因素的分布，减少处理效应估计的偏倚[16]。我们采用1∶3最近邻匹配法、设定卡钳值为0.03，匹配了女性患者年龄、移植胚胎数、移植优质胚胎数3个影响临床妊娠结局的关键因素后[17-18]，得到两组间协变量相对均衡的对照组样本，从而使分析的结果尽可能的真实和可靠[19]。

本研究的分析结果显示，无论在卵裂期胚胎移植周期中还是在囊胚移植周期中，实验组与对照组相比各项指标均呈现相类似的变化趋势，即实验组胚胎移植后种植率、HCG阳性率、临床妊娠率、异位妊娠率、早期流产率、活胎分娩率等临床结局与对照组的单次冷冻解冻胚胎移植后的结局无统计学差异(P>0.05)，也提示在患者年龄、平均移植胚胎数、平均移植优质胚胎数平衡的条件下，重复玻璃化冻融对胚胎的种植及移植后临床结局并无显著影响。2011年Schlenker等[20]对染色体筛查(comprehensive chromosome screening，CCS)患者囊胚移植结果的研究也表明，经历玻璃化冻融-活检-玻璃化冻融-移植之后种植率与单次冻融的整倍体囊胚移植结局相当(62.2%vs.63.6%)，移植后的临床妊娠率为76.2%(16/21)。虽然本研究中的种植率和临床妊娠率，都明显低于Schlenker等[20]的研究，这主要是由于其数据来源于筛选后的整倍体囊胚的移植结局。但是，两个研究结果同样都提示重复冻融胚胎移植后的种植率及临床妊娠率与单次冻融胚胎无显著差异，其原因一方面可能与玻璃化冷冻解冻技术的发展成熟有关，另一方面也与样本中大多数重复冻融胚胎为优质胚胎有关，优质胚胎耐受降温和复温损伤能力相对较强[21]。当然，受收集样本的局限，本研究结果仍需要更大样本量的随机对照实验验证。