胚胎培养微滴内的温度变化研究

徐士儒，姚志鸿，熊风，李观贵，孙青，万才云，陈培林，钟惠娴，曾勇

(深圳中山泌尿外科医院生殖中心，深圳市围着床期生殖免疫重点实验室，深圳中山生殖与遗传研究所，深圳 518045)

体外受精-胚胎移植(IVF-ET)中，胚胎培养环境是影响胚胎生长发育及IVF-ET结局的重要因素[1]。在体内，胚胎在母体子宫中发育，是一个恒温恒湿的稳定生理环境[2]。但在体外，胚胎通常培养在培养皿微滴里，依靠CO2培养箱维持微滴一个类似子宫的稳定环境。然而，目前的胚胎培养方式，仍不可避免将胚胎移出培养箱行离箱观察及操作。离开CO2培养箱的胚胎可能面临温度、pH值及渗透压等变化所导致的应激反应，影响胚胎的发育潜能。我们主观上尽量减少离箱操作时间，选择快速恢复培养皿内微滴温度等条件的胚胎培养箱。但仍无相关数据表明微滴在离箱操作过程中温度的变化及操作时间是否合理及培养箱中微滴的复温时间的长短。因此，本研究利用商品化温度测定仪自组装一套简易的微滴温度检测装置，对离箱操作条件下微滴温度变化及放回不同类型CO2培养箱后微滴温度恢复时间进行检测，为胚胎实验室临床工作提供理论指导。

材料与方法

一、研究对象

1.试剂与耗材：配子受精培养液，血清蛋白替代物(SPS)，组织培养油均购买于美国SAGE公司，4℃冰箱保存。3001胚胎培养皿和定量移液管分别购买于美国 BD FALCON和美国COSTAR公司。热平板(MATS-UST2)为日本Tokai hit公司产品，使用前校准至37℃。研究中涉及的大型箱式培养箱(C200，Labotect，德国)(#1)，小型箱式培养箱(APM-30D，Astec，日本)(#2)，桌面干式培养箱(EC9-230L1，Astec，日本)(#3)，桌面湿式培养箱(K-MINC-100，COOK，美国)(#4)为胚胎实验室常用的三气CO2培养箱，设置参数至37℃，5%CO2，5%O2。温度测定仪(EA11A)购买于美国Extech公司，手工将其温度探头与3001胚胎培养皿皿盖偶联(图1)，用于测定培养皿中微滴温度，使用前参照产品说明书校准。

二、研究方法

1.本研究涉及4种不同类型的商品化培养箱，1号(#1)为大型箱式培养箱；2号(#2)为小型箱式培养箱；3号(#3)为桌面干式培养箱；4号(#4)为桌面湿式培养箱。

2.培养皿及微滴准备：实验培养皿及微滴与胚胎培养室常规工作中的培养皿及微滴准备方法相同。即在3001胚胎培养皿中加入35 μl含10% SPS的配子受精培养液并立即加入2.5 ml组织培养油。准备好的培养皿放置37℃，5%CO2，5%O2条件下平衡。

3.热平板上微滴温度测量：连接培养皿中的温度探头至温度测定仪，待温度稳定后读数，快速取出，置于热平板上，每隔30 s记录一次温度测定仪示数，共记录30 min(图1)。该测量进行3次生物学重复。

图1 培养皿微滴温度测定示意图

4.培养箱内微滴温度测量：取出平衡后的培养皿，温度下降至30℃时，快速放回培养箱，记录温度每升高0.5℃所需时间，直到最终稳定在37℃。每种型号培养箱共进行3次生物学重复。

三、统计学分析

采用SPSS 24.0统计软件进行数据的统计分析，均数比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、测量时培养室内环境

培养室内环境如温湿度是胚胎培养室每日常规质量控制指标，胚胎培养过程中需要维持实验室内环境的稳定。本实验在胚胎实验室进行，测量时培养室内的温度为(25.0±0.5)℃，相对湿度为(73%±7.8%)，实验中均关闭百级层流系统，每次测量时培养室内环境保持相对稳定。

二、热平板上微滴温度变化

随着培养皿离开CO2培养箱，在热平板上操作时间的延长，微滴内的温度呈现逐渐降低的趋势(图2)。离箱操作3 min，微滴温度降至(36.50±0.52)℃；离箱操作5 min，微滴温度降至(36.17±0.67)℃；10 min时降至(35.53±0.64)℃；10 min以后，微滴温度趋于平稳，直到30 min时，微滴温度仍能维持在(35.23±0.21)℃。

图2 培养皿中微滴在热平板上温度变化

三、不同类型商品化培养箱中微滴复温时间

#1至#4培养箱中微滴温度由30℃恢复至37℃的时间分别为(10.13±1.86)min、(24.71±4.37)min、(8.69±0.58)min、(8.59±2.01)min；由35℃恢复至37℃的时间分别为(5.58±1.37)min、(15.69±5.19)min、(5.21±0.45)min、(4.88±0.51)min。其中#2培养箱由30℃及35℃恢复至37℃的复温时间均显著长于#1、#3、#4培养箱(P<0.05)，#4培养箱恢复至37℃的时间最短，但统计学上#1、#3、#4培养箱的复温时间无显著性差异(P>0.05)(图3)。

注：与#1、#3、#4 CO2培养箱相比，*P<0.05图3 不同类型商品化培养箱中微滴复温时间

讨 论

体外胚胎培养是IVF-ET过程涉及的主要环节之一，胚胎的质量直接影响移植后的最终临床结局。除去配子及胚胎本身质量外，影响胚胎培养的外部因素很多。从胚胎实验室角度，主要有环境因素、操作因素等，其中环境因素多而复杂，影响明显。环境因素主要包括培养室内环境、培养箱内环境、培养皿微滴内环境，如温度、pH等。然而，由于监控的复杂性，目前胚胎实验室广泛关注的是培养室内环境及培养箱内环境，很少对培养皿微滴内的环境进行质量控制。但是培养皿微滴是胚胎直接接触的液体环境，相当于母体子宫，所以微滴内的环境才是关键的因素之一。因此，本研究关注于胚胎培养皿微滴内的环境，通过自组装的一套简易装置实现对培养皿微滴内温度的监控，探究培养皿离开培养箱放置于热平板上的温度改变情况以及重新放回培养箱后的复温时间，指导实验室日常工作，为胚胎培养体外操作及如何选择更加适合的培养箱提供重要依据。

温度对胚胎发育的影响显而易见，人的基础体温是37℃，常规理论认为，37℃是配子体外受精及胚胎发育的最适温度[3-4]。然而，有动物研究表明，输卵管局部的温度低于中心体温1.5℃左右[5-8]，而人卵泡内温度甚至比中心体温低2.3℃[9-10]。因此，根据“回归自然”(back to nature)的胚胎培养理念提出，比37℃略低的温度(如36℃)可能更有利于胚胎发育[9]。Higdon等[11]一项回顾性研究结果也表明，36℃的培养箱环境能够提高临床妊娠率。Hong等[12]的前瞻性随机对照(RCT)研究结果表明，相比36℃培养环境，传统的37℃条件培养，能够获得更好的第3天胚胎及更高的囊胚形成率，但是胚胎非整倍体率及移植后的妊娠率无显著性差异。因此，目前对于胚胎培养的最适温度仍然存在着争议。但是，过低的温度对于配子及胚胎的损伤是明确的，低温除了降低胚胎内正常代谢外，主要影响纺锤体的形态及稳定性，对其他细胞期的影响也是不可避免的，造成不可逆的细胞损伤，影响胚胎质量及种植潜能，导致受精率，卵裂率和妊娠率下降[13-16]。有研究表明，成熟卵母细胞在33℃下，纺锤体会在5 min内开始解聚，10 min内完全消失，随着温度的降低，完全消失的时间将逐渐缩短，纺锤体恢复的时间将延长，甚至是永久性损伤[17]，低温也会使得卵母细胞的非整倍体几率增加[18]。

体外胚胎培养过程中，目前仍无法实现从开始到结束胚胎始终不离开培养箱，因此，低于37℃的温度是不可避免的，主要出现在两种情况：一种是从培养箱取出胚胎培养皿放置于恒温热平台上进行离箱操作及观察；另外一种是培养皿从箱外回到培养箱尚未恢复温度。因此，离箱操作所用时间内引起的培养皿微滴温度变化幅度及培养箱复温能力十分重要。本研究结果表明，培养皿离开CO2培养箱，随着在热平板上操作时间的延长，微滴内的温度呈现逐渐降低，前10 min内每分钟温度降低约0.16℃。10 min以后，微滴温度趋于平稳。由于目前对于胚胎培养的最适温度仍有争议，所以对于温度低于多少开始对配子及胚胎产生影响尚不明确，2010年美国生殖年会上，Sherbhn[19]在报告中提到，取卵时卵泡液温度超过36.4～36.9℃这一范围，将影响胚胎囊胚形成率、着床率及活产率，提示配子及胚胎在体外离开培养箱后，温度降至36.4℃下，可能开始对后期发育产生影响。因此，结合本研究结果，为保证在热平板上微滴内的温度能够维持在36.4℃以上，建议离箱操作配子及胚胎的时间应尽量控制在3 min以内，对于卵母细胞数或者胚胎数较多的情况，可以采用分批操作的方法，减少每一批次体外操作的时间，从而维持胚胎在一个适宜的环境下。完成离箱观察和操作的配子应立即放回培养箱中恢复至适宜温度。因此，选择合适的胚胎培养箱，在最短的时间内恢复培养皿中微滴温度也非常必要。

CO2培养箱是胚胎实验室的最常用的设备之一，主要用于控制胚胎培养环境。通过在培养箱内模拟形成一个类似人体内的生长环境，即稳定的温度、O2水平、CO2水平、相对湿度等，目前商品化培养箱品牌多、种类杂。如何选择一个好的培养箱尚缺乏行之有效的指标，不同的研究者也有不同的结论[20]。其中，复温时间可能是一个十分重要的参考指标。本研究系统性的检测了目前市面上比较典型的大型箱式培养箱(#1)，小型箱式培养箱(#2)，桌面干式培养箱(#3)和桌面湿式培养箱(#4)的复温时间。结果显示微滴在4种不同类型的CO2培养箱中由30℃恢复至37℃的时间存在差异，分别为(10.13±1.86)min、(8.69±0.58)min、(24.71±4.37)min、(8.59±2.01)min，由35℃恢复至37℃的时间分别为(5.58±1.37)min、(5.21±0.45)min、(15.69±5.19)min、(4.88±0.51)min。其中，#2小型箱式培养箱的复温时间显著长于#1、#3、#4培养箱(P<0.05)，#4培养箱的复温速率最快，恢复至37℃所用时间最短，但#1、#3、#4培养箱的复温时间彼此之间无显著性差异(P>0.05)。因此，从温度方面进行考虑，应尽可能选择复温时间较短的培养箱进行胚胎培养，而在热平板上进行体外操作及观察时则尽可能将时间控制在3 min之内。若需在实验室进行不同培养箱的数据监控，则还需要结合其他指标，如pH的控制、系统稳定性、以及使用的便捷性等数据。当然，无论选择何种胚胎培养箱，最终还是应关注胚胎的生长发育结局及临床结局，才能更好的对实验室进行质量控制。