氢气对原代人大肠腺癌细胞生长的抑制作用及其影响因素

周晓，李宪孟，秦树存

(1山东医学高等专科学校，山东临沂276000；2泰山医学院)

1975年，Dole等[1]证实高压氢气能抑制小鼠皮肤原发性鳞状细胞癌生长。随后研究人员通过富氢培养液对多种肿瘤细胞株干预的体内和体外实验均证实，氢气对肿瘤细胞的增殖、迁移以及接种形成的种植瘤有抑制作用[2～6]。本研究原代培养不同病例来源的人大肠腺癌细胞，探讨氢气对癌细胞生长的抑制作用及影响因素。

1 材料与方法

1.1 材料 DMEM/F12培养基(Hyclone)，优级FBS(杭州四季青生物工程材料有限公司)，胰蛋白酶-EDTA消化液、快速姬姆萨染液(Solarbio)。MTT试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，Annexin-V-FITC-PI双染细胞凋亡检测试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、即用型SP免疫组化试剂盒(南京建成生物工程研究所)。小鼠抗人CK-19抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)。富氢培养液：采用AYH-300型高纯氢气发生器(纯度>99.99%，北京天雨泽科技有限公司)，在0.4 MPa压力下制备富含饱和氢气的DMEM/F12培养液，置于4 ℃冰箱储存并于1周内使用。使用前检测氢气浓度，以确保不低于0.6 mmol/L。

1.2 大肠腺癌细胞获取、培养及分组处理 大肠腺癌细胞取自30例大肠腺癌患者。患者均于2015年11月～2017年7月于山东省临沂市肿瘤医院行大肠癌手术，病理明确诊断。其中男15例，女9例；年龄49～78(64.3±9.4)岁，≤60岁11例、>60岁13例；肿瘤位于结肠10例，位于直肠14例；Dukes A～B期8例，C～D期16例；Ki67阳性率≤70% 10例，>70% 14例；血浆MDA≤3 μmol/L 14例，>3 μmol/L 10例；患者术前均未接受任何抗肿瘤治疗。术中无菌条件下取内部无坏死的肿瘤组织，充分清洗后用胰蛋白酶反复消化。收集消化液，加入FBS终止消化，1 000 r/min离心5 min，DMEM/F12+2% FBS重悬细胞，以3×105个/mL细胞密度进行原代培养。结合反复贴壁法和机械刮除法去除成纤维细胞。经细胞免疫组织化学CK19染色后，24例细胞质出现淡黄至棕黄色阳性颗粒，证明肿瘤均为上皮细胞来源，原代大肠腺癌细胞培养成功。当细胞融合约80%左右时传代，取2～3代对数生长期细胞随机分为两组，对照组给予含10%血清的DMEM/F12培养液培养，氢气组给予含10%血清饱和氢气(≥0.6 mmol/L)的DMEM/F12培养液培养。

1.3 细胞活性检测 采用MTT法。将所有患者来源的肿瘤细胞接种于96孔板，每孔加入100 μL共2×104个细胞，每组设5个复孔。待细胞进入对数生长期时参照1.2方法进行分组干预，继续培养24 h终止培养。每孔加入10 μL MTT溶液于37 ℃避光孵育4 h，再加入100 μL Formanzan溶解液于37 ℃避光孵育4 h。将空白孔调零，于酶标仪562 nm处测定各孔光密度(OD)值。

1.4 细胞克隆情况检测 采用克隆形成实验。取对数生长期细胞消化成单细胞悬液，在 6孔板中每孔种植2.0×102个细胞，每组设3个复孔，加入普通培养液培养24 h，参照1.2方法进行分组干预，每隔24 h更换新鲜制备的富氢培养液，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养4天。终止细胞培养，吸尽培养液，PBS洗涤2次，甲醇固定15 min，Giemsa染色15 min，洗去染色液，空气干燥。倒置显微镜下观察，计数>10个细胞的克隆数。

1.5 细胞凋亡情况检测 采用流式细胞术将1.2中两组细胞培养24 h，经胰酶消化成单细胞悬液，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，PBS 重悬细胞。取含有1×106个细胞的重悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入500 μL结合液重悬细胞。加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，混匀，再加入5 μL PI，混匀，室温避光孵育10 min。1 h内上机用流式细胞仪检测细胞凋亡率，激发波长488 nm，发射波长530 nm。

2 结果

2.1 两组细胞活性、克隆数量及凋亡情况比较 对每例患者来源的细胞分别统计氢气组和对照组的OD值，克隆数量及凋亡率，根据三项指标的变化，分为氢气干预有效和无效细胞，分别统计两类细胞上述三项指标。结果显示，氢气组15例患者的原代结肠癌细胞OD值、克隆数量均低于对照组(P均<0.05)，细胞凋亡率高于对照组(P<0.05)，提示氢气干预有效。氢气组9例患者的原代结肠癌细胞OD值、形成的克隆数量和细胞凋亡率与对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，提示氢气干预无效。两组氢气干预有效及无效细胞相关指标比较见表1、2。

表1 两组氢气干预有效细胞活性、克隆数及凋亡率比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

表2 两组氢气干预无效细胞活性、克隆数及凋亡率

2.2 氢气对大肠癌细胞的干预效果与患者临床病理参数的关系 对15例氢气干预有效的大肠癌原代细胞来源患者的临床病理参数进行单因素分析，结果显示，血浆MDA>3 μmol/L和癌细胞Ki67表达阳性率>70%患者的原代癌细胞被氢气抑制的概率高于血浆MDA≤3 μmol/L和癌细胞Ki67表达阳性率≤70%患者(P均<0.05)；患者性别、年龄、肿瘤位置及Dukes分期对原代癌细胞是否被氢气抑制无显著影响(P均>0.05)。见表3。

表3 氢气对大肠癌细胞干预效果与患者临床病理参数的关系

3 讨论

目前已知的能够被氢气抑制的细胞株包括人舌鳞状上皮细胞癌(HSC-4)、人肺腺癌(A549)、人纤维肉瘤(HT-1080)、Ehrlich腹水肿瘤(EAT)、人结直肠癌(SW480)、鼠大肠癌细胞(Colon26)等[1～6]，以大肠癌来源的细胞株较多，提示氢气有可能成为大肠癌患者新的抗肿瘤化学药物。

全身化学治疗是不适合手术切除的大肠癌患者的主要治疗方法。但化疗药物的毒副作用大，如奥沙利铂(OX)导致的累积性末梢神经障碍，术后辅助化疗采用FLOX方案的患者多出现腹泻等[9]。氢气作为一种潜在的抗肿瘤药物，迄今为止未发现其对人体有任何毒副作用，具有广阔的应用前景；但是，目前关于氢气抗肿瘤的研究仅局限于对少数几种细胞株的观察，试验结果的适用性较差，还因为缺少患者的信息，无法对临床病理特征与氢气抗肿瘤效果的相关性进行分析，尚不能为氢气的实际应用提供可靠的依据。

本研究采集30例大肠腺癌患者的手术切除标本进行原代细胞培养，24例培养成功，成功率为80%。污染是原代培养失败的主要原因，说明利用原代细胞培养进行氢气抗癌研究具有一定的局限性。本研究观察了氢气对24例原代癌细胞活性、增殖和凋亡的影响，发现氢气仅对15例患者来源的癌细胞具有抑制作用，有效率为62.5%。Asada等[6]报道氢气对人肝癌细胞株(HepG2)没有抑制作用，提示氢气的抗肿瘤作用受细胞株种类的限制。本研究提示，氢气的抗肿瘤作用会受到细胞株来源的影响，因为不同大肠癌患者的原代癌细胞类似于不同来源的细胞株。本研究中氢气有效原代癌细胞对照组的OD值、克隆数和凋亡率均数均高于氢气无效对照组，也提示癌细胞本身的生物学特性是影响氢气效果的重要因素。

目前认为，清除活性氧(ROS)、抗氧化是氢气发挥生物学作用的主要机制[10]，包括抗肿瘤作用[2]。不同肿瘤细胞的基因突变对ROS的产生和清除途径有不同的影响[11～14]，细胞内ROS水平不一致可能是氢气抗肿瘤作用出现差异的原因。MDA是自由基引起的脂质过氧化过程中生成的一种醛类物质，是ROS氧化细胞膜上的多不饱和脂肪酸形成的脂质过氧化物，其血浆含量可间接反映组织及细胞受ROS损伤的程度[15]。血浆MDA含量高的患者可能处于氧化还原失衡的状态，有助于氢气发挥抗肿瘤作用。目前已证实氢气能够降低氧化应激时细胞内MDA含量[16]。氧化/还原剂作为化疗药物治疗肿瘤目前尚有争议。因为肿瘤细胞的氧化还原状态受很多因素的影响，对肿瘤所起的作用也不确定。一些研究通过检测患者的临床指标，如胰腺癌和肝癌患者的血浆硫氧还蛋白、肿瘤组织的抗氧化能力等预测氧化/还原剂的抗肿瘤疗效[17,18]。本研究发现，血浆MDA能够影响氢气对原代癌细胞的抑制作用，提示将来可能通过检测MDA预测氢气的抗肿瘤效果，筛选适合氢气治疗的大肠癌患者。

持续的增殖活性是恶性肿瘤细胞的主要特征，很多抗肿瘤药物通过抑制肿瘤细胞增殖发挥作用[19]。Ki67是反映肿瘤细胞增殖活性、判断肿瘤侵袭能力的重要参考指标，在临床中广泛应用[20]。有报道称氢气能够降低肿瘤组织Ki67表达[21]。本研究发现，大肠腺癌组织Ki67表达普遍较高，以阳性率为70%作为界限进行分析，界限两侧癌细胞被氢气抑制的概率也有显著差别。这一结果也与细胞实验中氢气有效15例原代癌细胞对照组的克隆数和OD值均数均高于氢气无效9例对照组相吻合。究其原因，可能与增殖旺盛的恶性肿瘤细胞增殖信号较强，ROS在信号传导途径中具有中介作用[21]，有利于氢气发挥作用有关。

本研究尚存在一些缺陷。首先，样本量小，得出的结论尚需更大样本量的研究证实；其次，选取样本的随机性较强，一些指标如肿瘤的组织学类型因为各样本大致相同而难以进行分析；再次，本研究患者均为初次诊断和治疗，所得出的结论不一定适用于复发或者已经进行过治疗的大肠癌患者；最后，仅分析了氢气对大肠癌原代细胞的作用以及影响这种作用的临床因素，没有进行机制方面的进一步研究。

综上所述，氢气对原代人大肠腺癌细胞生长具有一定的抑制作用，血浆MDA含量和肿瘤组织Ki67表达可能影响氢气的临床抗肿瘤效果。