胰腺导管细胞癌组织CSF3R基因表达对患者预后的影响及其机制

方天逸，王宇夫，林轩，王浩，崔云甫

(哈尔滨医科大学附属第二医院，哈尔滨150001)

近年来，表观遗传学关于胰腺癌的研究取得了巨大进步，“炎癌转化”假说已经得到广泛认可[1]。肿瘤组织中的炎性细胞，特别是嗜中性粒细胞是目前研究的热点[2]。学者们致力于寻找与嗜中性粒细胞高度相关，甚至可在一定程度上代表肿瘤组织内嗜中性粒细胞募集程度的基因。慢性中性粒细胞白血病是一种以血液中嗜中性粒细胞恶性增多为主的疾病，主要由粒细胞集落刺激因子3受体(CSF3R)基因突变导致[3]。CSF3R不仅在骨髓中高表达，在胆囊、肺脏、膀胱、肾脏等组织也被检测到不同程度的表达[4]。目前CSF3R基因在实体肿瘤中作用的研究刚刚起步。2017年12月～2018年2月，本研究通过公开数据库GEO中的芯片数据，利用R2平台，采用生物信息学技术方法分析了CSF3R与胰腺导管细胞癌患者总体生存率的关系，并分析其相关的作用机制和信号通路，旨在为进一步深入研究CSF3R基因与胰腺导管细胞癌的关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中下载基因表达谱公共数据集GSE21501，此数据集包含CSF3R表达数据的人类胰腺导管细胞癌表达谱，包括132例份胰腺导管细胞癌患者的癌组织标本(30例份标本无生存资料)，分别来自北卡罗来纳大学教堂山分校、西北大学纪念医院、北岸大学、内布拉斯加医学中心和霍普金斯医疗机构等医疗机构。其中原发性胰腺癌117例，转移性胰腺癌15例。T分期：T1期2例，T2期18例，T3期90例，T4期2例；N分期：N0期34例，N1期81例；M分期：M0期116例，M1期15例；分化程度：低分化5例，中分化55例，高分化51例；切缘阳性16例、阴性63例；新辅助治疗113例。注：内布拉斯加医学中心的15例份标本缺失T分期、N分期、分化程度、切缘情况、新辅助治疗等资料；霍普金斯医疗机构的34例份标本缺失切缘情况资料。

1.2 实验方法 采用Allprep试剂盒(Qiagen)从快速冰冻肿瘤组织中提取癌细胞RNA，纳升分光光度计定量Bioanalyzer2100评估RNA质量。利用R2分析平台(http://r2.amc.nl)进行基因表达情况与生存数据的相关性运算，通过Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路分析及Gene Ontology(GO)分析方法对CSF3R的相关基因通路进行初步分析。生存数据的处理采用Kaplan-Meier法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CSF3R表达与患者总体生存率的关系 CSF3R高表达患者62例，低表达患者40例；CSF3R表达水平与患者的总体生存率呈负相关(P=0.015)，高表达患者的总体生存率低于低表达患者(P<0.05)。见图1。

图1 CSF3R表达与患者总体生存率的关系

2.2 与CSF3R相关的基因 利用R2分析平台，对数据集GSE21501中132个胰腺导管细胞癌患者的全部基因进行统计学分析，检测出与CSF3R表达呈显著相关的基因共6 521个，其中正相关基因3 040个、负相关基因3 481个，前20位正负相关基因见表1。

表1 与胰腺导管细胞癌患者CSF3R表达呈正负相关的前20位基因

2.3 基因通路 KEGG分析发现，与CSF3R相关的6 521个基因中，有1 943个基因涉及不同的信号通路。当取P<0.001时，27个CSF3R高表达基因(C1QA、C1QB、C1QC、C2、C3AR1、C5、C5AR1、FCAR、FCGR2A、FCGR2B、FCGR3A、FCGR3B、FGG、FPR1、FPR2、FPR3、HLA-DMB、HLA-DQA1、HLA-DQB1、ICAM1、ITGAM、ITGB2、MASP1、MASP2、MBL2、PLG、SELPLG)仅涉及1个信号通路，即金黄色葡萄球菌感染。GO分析发现，CSF3R及其相关基因主要与细胞对刺激的反应、免疫反应、RAS调控、胰腺发育等相关。见表2。

表2 与胰腺导管细胞癌患者CSF3R相关基因的GO分析

3 讨论

胰腺导管细胞癌的恶性程度远高于其他实体肿瘤[5]。胰腺癌具有特殊的解剖结构以及复杂的肿瘤微环境，肿瘤组织长期处于缺血和低氧环境，肿瘤细胞具有高度的异质性和异常的代谢模式[6]，但这些尚不能充分解释胰腺癌的发病机理。随着研究的不断深入，胰腺癌组织全基因组测序技术的成熟和分子生物学的长足发展，为更深层次了解胰腺癌的生物学特征提供了条件，推动了胰腺癌早期诊断和特异性靶向治疗的发展。

CSF3R是一种蛋白质编码基因，又名粒细胞集落刺激因子受体，位于1号染色体的p34区，由17 272个碱基构成，有19个外显子。该基因可以调控粒细胞的生成、分化和信号传导[7]。CSF3R基因起初被认为在粒细胞的生长和发育中发挥重要作用[8]。Maxson等[9]发现血液系统肿瘤中CSF3R突变，揭开了其在血液系统肿瘤研究的序幕。目前认为，CSF3R突变与重度先天性中性粒细胞减少症关系密切，可诱发其发展为急性髓细胞白血病(AML)[10]。CSF3R突变包括CSF3R T618I和CSF3R T615A两种类型，常合并SETBP1基因突变[11]。

本研究对选取的芯片数据进行Kaplan-Meier生存曲线分析证实，CSF3R对于胰腺导管细胞癌患者的总体生存期有明显的预测作用，CSF3R高表达患者的总体生存期明显短于低表达患者。尽管数据库中有30例患者生存资料缺失，但仍提示CSF3R是一个明显的促癌因素。本研究通过R2分析平台检测出与CSF3R表达显著相关的基因共6 521个，经计算与其高度正相关的部分基因均发挥不同程度的促癌作用。Hou等[12]报道，FPR2表达水平与胃癌恶性程度、淋巴结转移情况呈正相关；Wang等[13]报道，CXCR2在胃癌细胞的增殖和侵袭中起重要作用。对这6 521个基因的KEGG分析结果显示，CSF3R高表达时仅涉及金黄葡萄球菌感染信号通路。Wang等[14]认为，胰腺癌组织中炎性细胞浸润程度越高，患者预后越差；Bayne等[15]报道，肿瘤来源的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是胰腺癌组织内炎症和免疫抑制的重要调节剂。葡萄球菌感染灶内主要的炎性细胞为中性粒细胞。我们推测CSF3R高表达导致患者总体生存率降低可能与中性粒细胞的三种杀伤途径有关，即吞噬、脱颗粒和中性粒细胞外网(NETs)。在吞噬过程中，为了消除和降解微生物，活性氧(ROS)、防御素和丝氨酸蛋白酶在吞噬体中释放。ROS的持续释放导致由中性粒细胞局部浸润的组织微环境持续缺氧，而慢性持续性低氧环境在胰腺导管细胞癌的发生、侵袭和转移中发挥重要作用。Abdol Razak等[16]研究表明，胰腺癌细胞会刺激周围中性粒细胞产生NETs，而NETs可促进ROS对肿瘤组织及其间质的杀伤作用，进而诱导多种致癌因子的产生。Geller等[17]研究发现，胰腺癌对吉西他滨产生耐药是由于肿瘤组织中存在可以产生胞苷脱氨酶的特异性细菌；这些细菌可以代谢化疗药物，并募集中性粒细胞，使肿瘤产生耐药性，这也从一个新的角度阐释了细菌、炎症和肿瘤相互促进的关系。本研究 GO分析结果显示，CSF3R与其相关基因在细胞炎症反应中发挥了一系列功能，如免疫反应、白细胞激活等。此外，其激活的ErbB信号通路也可以调控直肠癌细胞的增殖、浸润和转移[18]。在本研究数据集中CSF3R高表达导致胰腺癌患者不良预后，该结果为今后研究CSF3R在胰腺癌发展中作用的相关机制提供了思路。

转录组学的发展使临床对胰腺癌有了新的认识。转录组学与目前的细胞学研究不同，其虽可在短时间内检测到人类细胞或组织中所有基因的转录表达，但这种通过公共平台的分析方法无法描述细胞间化学相互作用的真实情况。其次，其统计结果只适用于群体患者，而不适用于单一患者，因此需要更大的样本量进行进一步的研究。通过公共基因芯片数据进行分析，具有快捷、简便、样本量大的优势。本研究中CSF3R表达与胰腺癌患者的总体生存率呈负相关，可以为下一步CSF3R与胰腺癌相关分子机制的研究提供参考。