内皮素A受体拮抗剂BQ-123对蛛网膜下腔出血大鼠学习记忆功能的影响

刘俊杰 王婧瑶 梁文吉 王一超 张婧曦 孙竹梅 赵 旭 赵雅宁 李建民

(华北理工大学，河北 唐山 063000)

自发性蛛网膜下腔出血(SAH)致残率高、发病多见于中青年，严重威胁人类健康和生命。随着临床诊疗技术的提高，患者的存活率显著提高，但存活下来的患者约20%伴有认知功能障碍〔1,2〕。自噬是指通过对蛋白质聚集体，长寿命蛋白及受损细胞器的降解和回收利用以维持内环境稳定的细胞代谢过程，其在饥饿、缺氧、内质网应激、线粒体损伤及使用一些药物干预时均可被诱导激活，是促进细胞存活的重要机制〔3〕。课题组前期研究发现SAH在造成神经损伤的同时也会改变自噬过程，且自噬主要发生于神经细胞中〔4〕。内皮素(ET)A受体属于7次跨膜耦联G-蛋白受体的超家族，文献报道，SAH后可发现ETA的高表达〔5〕。因此ETA成为可能的药物调控靶点。ET受体(ETR)拮抗剂BQ-123是一类高特异性亲和力，可与ET竞争性结合ETA受体〔6〕。本研究应用BQ-123ETA对SAH大鼠进行治疗性干预，观察大鼠学习记忆功能改变及神经细胞自噬的水平。

1 材料与方法

1.1动物及分组 144只SPF级雄性SD大鼠(体重350～400 g)，购自华阜康实验动物有限公司〔动物许可证号SCXK(京)2016-003〕。饲养于华北理工大学医学研究中心，适应性喂养1 w，自由进食水。所有实验操作均经华北理工大学伦理委员会批准。采用随机数字表法将144只大鼠分为Sham组、SAH组、BQ-123组，每组再按取材时间点不同，随机分为6、24、72、144 h亚组(n=12)。

1.2主要试剂与仪器 多克隆Beclin-1和LC3-Ⅱ一抗(美国Santa Cruz公司)，二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，磷酸盐缓冲液(PBS)及柠檬酸盐缓冲液(武汉博士德)，大鼠脑立体定位仪(深圳瑞沃德)，OLYMPUS摄像显微镜(日本奥林巴斯公司)，图像采集及分析系统(北京航空航天大学)。

1.3SAH模型制备及给药 如文献所述〔7〕，采用经典自体血枕大池二次注血法：采股动脉非抗凝动脉血0.3 ml，颈后正中切口，暴露环枕膜，刺破环枕膜向枕大池注射自体动脉血，48 h后重塑一次。Sham组只手术暴露，不进行环枕膜穿刺及枕大池注射，余操作均与SAH组完全一致。模型成功判定标准：①注射成功后可以观察到大鼠呼吸、心率的加快，肌肉抽搐；②脑组织大体标本可在脑基底节区看到散在血凝块。BQ-123组：据Paxinos-Watson脑定位图，以前囟为零点，调节脑定位仪(AP:-0.8 mm;ML:1.5 mm;DV:3.3 mm)并标记。于标记点钻直径0.5 mm骨孔，微量注射器缓慢地注射BQ-123到侧脑室。剂量：18 μg，5 μl。

1.4行为学检测 各组大鼠在相应时间点分别置入穿梭箱内，实验开始前暗适应5 min，随后给予5 s的铃声刺激，再立即予以30 s电刺激，中间隔开20 s行下一次练习。试验中大鼠受到铃声刺激5 s内，能够迅速逃离危险区，则被界定为一次主动回避反应；若铃声刺激5 s,大鼠未逃离危险区，则再次予以30 s电刺激，如果此时大鼠逃向安全位置，计为1次被动回避反应。连续记录30次，收录遭受电击时间-被动回避潜伏期(PAL)、主动回避反应次数。计算主动回避反应次数占总训练次数的百分比即为主动回避反应率(AARR)。AARR越高，PAL越短，提示动物学习记忆能力越强，反之则越弱〔8〕。

1.5病理学检测 各时间点取5只大鼠，提前预冷的PBS缓冲液灌注，再用4%的多聚甲醛溶液灌注固定，固定后迅速取脑，多聚甲醛溶液中固定48 h，截取视交叉平面以后至大脑横裂以前段脑组织，冠状切割为3份，常规脱水、透明，石蜡包埋，切片，切片厚度为4 μm，进行HE染色。400倍显微镜下观察海马CA1区神经细胞形态变化，并计数存活神经元个数。

1.6Beclin-1和LC3-Ⅱ免疫组织化学染色 切片常规脱蜡至水，柠檬酸盐高压热修复，分别滴加Beclin-1多克隆抗体(浓度1∶200)、LC3-Ⅱ多克隆抗体(浓度1∶300)，4℃孵育过夜；滴加二抗，37℃温箱孵育30 min，DAB显色，梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。PBS代替一抗阴性对照，400倍显微镜下观察海马区细胞形态变化并计数阳性细胞数量。

1.7统计学方法 应用Graphpad Prism7.0建立数据库进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析、SNK法。

2 结 果

2.1BQ-123对SAH大鼠学习记忆功能的影响 与Sham组比较，SAH组大鼠对刺激反应迟钝，各时间点AARR均值显著降低，PAL时间显著延长(P<0.05)；与SAH组比较，BQ-123组大鼠反应较为灵敏，能够有效躲避电击，各时间点AARR显著升高，PAL时间显著缩短(P<0.05)。见表1，表2。

表1 各组大鼠不同时间点AARR比较

与Sham组比较：1)P<0.05；与SAH组比较：2)P<0.05，下表同

表2 各组大鼠不同时间点PAL比较

2.2BQ-123对SAH大鼠海马区神经细胞形态的影响 Sham组大鼠海马区神经细胞排列规整，细胞核饱满，近似圆形，核仁清晰。SAH组海马区神经细胞出现深染，胞核边界不清，核固缩、碎裂，核溶解，三角形的死亡细胞形态，其中正常形态神经细胞数量较Sham组明显减少(P<0.05)；而BQ-123组神经细胞形态损伤程度明显减轻，与SAH组比较，BQ-123组各时间点神经细胞数量均明显增多(P<0.05),见图1，表3。

图1 各组大鼠24 h海马CA1区神经元细胞形态变化(HE，×400)

组别6 h24 h72 h144 hSham组132.00±1.90132.50±1.37132.83±2.23132.83±2.13SAH组75.17±1.941)87.50±2.591)96.00±2.191)103.17±1.941)BQ-123组87.00±2.832)103.17±1.472)109.83±2.312)114.33±2.582)

2.3BQ-123对自噬因子的影响 Sham组大鼠海马CA1区Beclin-1、LC3-Ⅱ为弱阳性表达，偶可见阳性细胞，阳性细胞的胞质呈棕黄色淡染；与Sham组比较，SAH组每个时间点的Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白阳性细胞数量显著增多，且呈强阳性表达，胞质呈深棕黄色(P<0.05)；BQ-123组每个时间点Beclin-1、LC-3Ⅱ蛋白表达进一步增强，阳性细胞数量均较SAH组增多(P<0.05)，见图2，表4，表5。

图2 各组24 h海马CA1区神经元细胞Beclin-1及LC3-Ⅱ的表达(DAB，×400)

组别6 h24 h72 h144 hSham组23.83±1.3324.33±1.0323.67±1.3723.50±1.05SAH组31.00±1.411)45.33±2.341)37.17±2.141)30.33±2.581)BQ-123组 42.17±1.942) 58.00±0.632) 49.50±2.172) 37.17±1.942)

表5 各组大鼠海马区不同时间点LC3-Ⅱ表达结果个/高倍视野)

3 讨 论

AARR和PAL能客观地反映大鼠学习记忆功能。本研究结果提示，SAH后大鼠的学习记忆功能受损，而BQ-123治疗后大鼠的学习记忆能力有明显改善。BQ-123可以与ET-1结合，缓解血管痉挛、抑制交感神经系统及肾素-血管紧张素系统的活性〔9〕。文献报道，脑缺血再灌注损伤中BQ-123在血浆中与ET竞争性结合ETAR，进而缓解血管收缩，抑制血管痉挛，改善组织灌注压，使细胞缺血缺氧得到相应改善〔10〕，因此，BQ-123可以减少神经细胞的死亡，从而使学习记忆功能得到了改善。

本研究显示SAH组大鼠海马区存活神经元数目明显下降，而BQ-123组神经细胞的损害明显减少，BQ-123可以提高SAH后大鼠海马区Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达水平，增强自噬激活的程度，同时大鼠海马区神经细胞丢失数量明显减少。张云东等〔11〕研究发现BQ-123组可明显缓解脑血管痉挛，改善脑部血液流量。BQ-123的干预作用，使ET-1不能同ETA有效结合，不能有效水解磷脂酰肌醇，减少了钙离子释放，改善脑组织的血供〔10〕。而大量的ET-1与ETB的受体结合，释放内源性一氧化氮，缓解血管痉挛，舒张血管，缓解脑组织缺血缺氧的状态。Ceylan-Isik等〔12〕报道，ET-1能够降低Beclin-1表达下调，降低自噬的活性，BQ-123处理可以提高心肌细胞自噬的活性，ET-1与自噬存在密切调控关系。本研究显示，BQ-123可能是与ET-1竞争ETA受体，缓解脑血管痉挛，改善脑组织缺血缺氧，从而改变自噬的活化状态，减轻海马区神经细胞丢失，从而改善大鼠的学习记忆能力。但BQ-123对自噬的调控机制及相关靶点本实验未进行深入探讨，我们将作为后续研究的方向。

4 参考文献

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