石蜡切片中卵巢癌基因1第2外显子PCR-SSCP检测法建立

苗小艳 石 敏 李 岩 赵文娇 孔繁斗 赵春艳

(大连医科大学检验医学院，辽宁 大连 116044)

卵巢癌基因(OVCA)1是与卵巢癌、乳腺癌等有关的肿瘤抑制基因〔1～5〕，定位于人染色体17p13.3〔1〕，该区域在卵巢癌中发生杂合性缺失(LOH)的频率高达50%～86%〔2,6～9〕,研究显示该基因缺失可能在卵巢癌早期阶段即存在〔8〕。但关于OVCA1的生物学功能及其在肿瘤发生发展中的作用和机制目前尚不清楚。研究发现乳腺癌中OVCA1基因多个外显子存在碱基突变〔3〕，本研究拟建立石蜡包埋切片标本OVCA1第2外显子的聚合酶链反应(PCR)单链构象多态性(SSCP)检测方法。

1 材料与方法

1.1材料 石蜡包埋组织标本来自大连医科大学附属第一医院2009年经病理确诊的卵巢浆液性乳头状囊腺癌标本3例、卵巢浆液性乳头状囊腺瘤4例和正常卵巢组织3例。石蜡包埋组织基因组DNA提取试剂盒(TaKaRa DEXPATTM)、DNA marker和PyrobestTMDNA聚合酶试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，其余试剂为国产分析纯。

1.2基因组DNA的提取 按试剂盒说明进行操作：将2枚10 μm石蜡包埋组织切片放入1.5 ml Ep管中，加入DEXPAT试剂0.5 ml。100 ℃加热10 min，12 000 r/min 4 ℃离心10 min。将含有DNA水层移入另一新Ep管中作为PCR反应模板。PCR扩增 引物序列：上游5′-TTCCATCTCAATCTGGCTTC-3′，下游5′-CATCTGGGCCAGGCAAC-3′。扩增条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃延伸2 min。3%琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段。

1.3SSCP检测 5 μl DNA样品加入等量SSCP上样缓冲液〔10 ml上样缓冲液中含有去离子甲酰胺9.4 ml，0.5 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)0.4 ml，5% 溴酚蓝0.2 ml〕，混匀，98℃变性10 min，立即置于-20℃冰浴10 min。配制8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，将上述样品上样、200 V、4℃电泳。电泳结束后，取出凝胶，置于固定液(含40%乙醇、10%醋酸)中固定30 min，去离子水漂洗5 min，重复3次。加入银染溶液(0.012 mol/L硝酸银)染色20 min，去离子水洗涤5 s，重复3次。加入显色剂(1.5%NaOH、0.02%甲醛)轻轻晃动，显色30 s后，显色液变黄或出现棕色颗粒。更换显色液，轻轻摇动，5 min后将凝胶移入终止液(10%醋酸)终止显色反应。取出凝胶，吸水纸吸干表面水分，拍照记录结果。

2 结 果

2.1OVCA1基因第2外显子的PCR扩增结果 以提取自卵巢组织石蜡切片的基因组DNA为模板进行PCR扩增，3%琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段(271 bp)，可见PCR扩增产物成单一条带，条带位置正确。见图1。

2.2OVCA1第2外显子的SSCP检测结果 凝胶上可见3条清晰条带。10例卵巢组织标本中，DNA条带数目及位置相同。见图2。

1～3为卵巢浆液性乳头状囊腺癌，4～7为卵巢浆液性乳头状囊腺瘤，8～10为正常卵巢组织，M为DL500 DNA marker；下图同图1 OVCA1第2号外显子的PCR扩增片段

图2 OVCA1基因第2号外显子的SSCP检测

3 讨 论

卵巢癌是妇科恶性肿瘤中死亡率最高的疾病，具有发病隐匿、早期诊断困难、预后差等临床特点，绝大部分卵巢癌患者就诊时已属晚期，5年存活率仅为30%〔10〕，而早期卵巢癌的5年存活率可高达90%以上〔10,11〕。

抑癌基因缺失或突变导致功能丧失是肿瘤发生的重要机制。OVCA1是一个由12个外显子组成、编码443个氨基酸的抑癌基因〔2,6～9〕。有研究表明过表达OVCA1基因可抑制细胞增殖并阻滞于G1期〔3〕。敲除小鼠OVCA1基因后，肿瘤发生率明显增加〔4〕。过表达OVCA1可通过p16途径抑制卵巢癌细胞增殖〔12〕，并具有抑制卵巢癌细胞迁移和侵袭的作用〔13〕。研究还发现在卵巢癌、乳腺癌等肿瘤中存在OVCA1基因多个外显子突变〔3〕，但这种突变与卵巢癌发生发展的关系尚不清楚。

PCR-SSOP技术为点突变的检测手段〔14〕，具有简便、快速、灵敏度高、无需特殊仪器设备、价格低廉、无需已知突变位点及序列等优点，被广泛用于点突变的初步筛选〔14,15〕。本研究结果表明该PCR扩增条件适合OVCA1第2外显子扩增；本文所建立的SSCP电泳及染色条件适合用于OVCA1基因第2外显子单链构象的检测。本研究显示，所测3例卵巢癌和4例卵巢良性肿瘤中未检出点突变。

4 参考文献

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13孔繁斗,刘 丽,魏 巍,等.抑癌基因OVCA1体外对卵巢癌细胞 A2780迁移和侵袭的抑制作用〔J〕.中国肿瘤生物治疗杂志,2008;15(4):351-7.

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