薯蓣皂苷元体外作用对胶原诱导性关节炎小鼠Th1/Th2 型细胞因子的影响

2018-07-18郭亚春赵晓菲宋鸿儒

中国老年学杂志 2018年13期

郭亚春赵晓菲黄群李卫尹静白冰宋鸿儒

(承德医学院，河北承德 067000)

辅助性T细胞(Th)1与Th2细胞是一对相互制约的免疫细胞，主要通过分泌细胞因子参与机体的免疫反应，Th1与Th2细胞及其分泌因子的平衡对于机体的免疫微环境的稳定十分重要，一旦这种平衡关系被打破，可引发机体多种疾病的发生。研究表明，Th1与Th2失衡可能参与了类风湿关节炎(RA)的发病，调节Th1与Th2平衡成为目前研究RA治疗的焦点〔1〕。薯蓣皂苷元是穿龙薯蓣在机体内的代谢吸收产物，穿龙薯蓣具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤等作用〔2〕。中药穿山龙具有祛风除湿、舒筋活血、活血止痛等功效，临床用于治疗骨刺、骨性关节病、心血管疾病等。前期研究表明，穿山龙提取物薯蓣皂苷元对胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠灌胃治疗可以调节CD4+T细胞〔3〕。本研究拟探讨薯蓣皂苷元对Th1与Th2细胞的调节机制，为穿龙薯蓣的开发应用奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1实验动物 DBA/J小鼠，雄性，75只，7～8周龄，上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2012-0002，SPF级动物室常规饲养。

1.2实验仪器与试剂细胞培养箱、低温冰箱，美国Thermo公司；ScanSpeed 1580R离心机，丹麦Labogene公司；细胞操作超净台，美国ESCO公司；InnoScan 300 Microarray Scanner荧光扫描仪，Innopsys公司，Wellwash Versa芯片洗板机，Thermo公司；QAM-TH17-1试剂盒，Ray biotech公司；穿龙薯蓣皂苷元，中国南京春秋生物工程有限公司，纯度>98%；细胞增殖及毒性检测(CCK-8)试剂盒，日本同仁化学公司；鸡Ⅱ型胶原，Chondrex公司；弗式完全佐剂，Sigma公司；胎牛血清、RPMI1640培养基，Gibco公司。

1.3实验方法

1.3.1CIA模型建立及淋巴细胞分离制备CIA模型参照文献〔4〕，常规处死CIA模型鼠，浸泡于75%酒精中消毒5 min，超净台中无菌取出腹股沟淋巴结，200目滤网研磨制备淋巴细胞单细胞悬液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，0.4%台盼蓝计数并调细胞浓度。

1.3.2CCK-8检测药物毒性调整T淋巴细胞终浓度为2×106/ml，设空白组(单纯的1640完全培养基)、对照组(细胞悬液未加药物)、药物组(终浓度分别为3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 μmol/L)，每组设3个复孔，每孔终体积为200 μl，37℃、5% CO2培养箱中培养48 h，于44 h时，每孔加入20 μl CCK-8，继续培养4 h，取出培养板用酶标仪检测(450 nm,中速，30 s)OD值(A值)，计算细胞相对存活率，选择存活率在70%以上的药物浓度。细胞存活率=〔(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)〕×100%。

1.3.3CCK-8法检测淋巴细胞增殖分离好的淋巴细胞调整细胞终浓度为2×106/ml，分为空白组(单纯的1640完全培养基)、对照组(细胞悬液未加药物)、药物组(薯蓣皂苷元终浓度分别为3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 μmol/L)，种入96孔板中，每组设3个复孔，每孔鸡Ⅱ型胶原终浓度50 μg/ml、IL-2终浓度100 U/ml作为刺激剂，每孔终体积200 μl，37℃、5% CO2培养箱中培养48 h，于培养44 h时，每孔加入20 μl CCK-8，继续培养4 h，450 nm处酶标仪检测每孔OD值，计算各组细胞抑制率。

1.3.4实验分组 CIA模型鼠淋巴细胞单细胞悬液分为空白组(淋巴细胞加入IL-2刺激)、细胞模型组(淋巴细胞加入IL-2和胶原刺激)、薯蓣皂苷元高剂量组(淋巴细胞加入IL-2和胶原刺激及高剂量薯蓣皂苷元)、中剂量组(淋巴细胞加入IL-2和胶原刺激及中剂量薯蓣皂苷元)、低剂量组(淋巴细胞加入IL-2和胶原刺激及低剂量薯蓣皂苷元)，IL-2和胶原的终浓度分别为100 U/ml和50 μg/ml。

1.3.5基因芯片法检测各组细胞因子表达水平参照试剂盒将玻片芯片在室温平衡20～30 min后，将芯片放在真空干燥器干燥1～2 h。按试剂盒说明对细胞因子标准品进行梯度稀释。然后添加100 μl的标准液和样品到孔中，4℃过夜孵育。用1倍洗液Ⅰ进行清洗，每孔250 μl的1倍洗液Ⅰ，清洗10次，每次震荡10 s。然后换用1倍洗液Ⅱ通道进行清洗，每孔250 μl的1倍洗液Ⅱ，清洗6次，每次震荡10 s。离心检测抗体混合物小管，加入1.4 ml的样品稀释液混合均匀，添加80 μl的检测抗体到每个孔中，摇床孵育1.5 h，清洗同上。离心Cy3-链霉亲和素小管，加入1.4 ml的样品稀释液混合均匀，添加80 μl的Cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住玻片避光，摇床上孵育1 h，清洗同上。采用激光扫描仪InnoScan 300扫描信号，Cy3/绿色通道(激发频率=532 nm)。应用QAM-TH17-1数据分析软件进行数据分析。

1.4统计学方法应用SPSS22.0软件，组间比较用单因素方差分析，两两比较用t检验。

2 结果

2.1小鼠的成模情况模型鼠的背部及尾根部形成多处溃疡，毛色暗淡干枯，进食减少，体重下降。初次免疫28 d，后足足爪出现红肿、运动受限。见图1。

图1 小鼠足爪肿胀度，右为正常鼠，左为模型鼠

2.2CCK-8法检测药物对淋巴细胞的毒性情况淋巴细胞培养48 h后，3.125～25.000 μmol/L药物组的存活率均在70%以上，说明3.125～25.000 μmol/L的薯蓣皂苷元对T淋巴细胞无明显细胞毒性作用。见表1。

2.3CCK-8法检测淋巴细胞增殖情况各组小鼠淋巴细胞培养48 h后，药物组与对照组相比，出现一定抑制作用，3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 μmol/L药物组抑制率分别为0.083、0.215、0.498、0.722、0.905。根据抑制率，选择药物的3个剂量组分别为6.250、12.500、25.000 μmol/L。

表1 薯蓣皂苷元对淋巴细胞的毒性实验结果

与对照组比较:1)P<0.05

2.4各组细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-4、IL-5水平比较与空白组相比，细胞模型组IFN-γ表达水平明显升高(P<0.01)，经薯蓣皂苷元作用后IFN-γ表达水平有降低趋势，其中高剂量组对IFN-γ表达有显著的抑制作用(P<0.01)。细胞模型组TNF-α水平显著升高，与空白组比较差异有统计学意义(P<0.01)，经薯蓣皂苷元作用后TNF-α有降低趋势，但与细胞模型组比较差异无统计学意义。与空白组比较，细胞模型组IL-4水平明显上升(P<0.05)，经薯蓣皂苷元作用后IL-4水平有上升趋势，其中中、高剂量薯蓣皂苷元可以显著提高IL-4的水平(P<0.05)。与空白组比较，细胞模型组IL-5水平明显下降(P<0.01)，经低、中、高剂量薯蓣皂苷元作用后可以显著提高IL-5水平(P<0.01，P<0.05)。见表2。

表2 各实验组细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5水平比较

与空白组比较：1)P<0.05；2)P<0.01；与细胞模型组比较：3)P<0.05；4)P<0.01

3 讨论

大量的炎性细胞因子参与RA关节损伤的病理进程。在众多的炎性细胞因子中TNF-α发挥至关重要的作用，可以作用于滑膜及软骨细胞促进基质金属蛋白酶及前列腺素等活性物质释放，引起关节肿胀、疼痛及关节组织的溶解破坏。TNF-α还可以介导破骨细胞的激活及自噬作用，引起关节软骨及骨组织的侵蚀〔5〕。检测活动期RA患者体内TNF-α发现，TNF-α对早期评估RA活动度密切相关，并与IL -17等炎症因子存在明显的正相关〔6〕。研究显示TNF-α还可以通过改变Foxp3表型抑制调节性T细胞功能进而加重RA患者的病情〔7〕。抑制滑膜组织及血清中的TNF-α对RA的病情具有缓解作用〔8〕。IFN-γ是Th1细胞分泌的主要细胞因子，可以促进CD4+T淋巴细胞向Th1分化，抑制Th2细胞的分化及活化。在RA大鼠模型中，IFN-γ可以促进Th1/Th2 及其细胞因子向Th1方向偏移〔9〕。IFN-γ还可以作用于自然杀伤(NK)细胞，分泌高水平的IFN-γ，诱导B细胞的活化，促进树突细胞(DC)成熟，加剧RA的炎症反应〔10〕。还有文献显示，IFN-γ通过抑制核因子κB受体活化因子配基(RANKL)，进而抑制破骨细胞与成骨细胞的平衡，在骨形成的过程中具有负向抑制作用，加剧关节炎症及骨破坏〔11〕。Th2细胞的分化由初始的CD4+T淋巴细胞通过T细胞抗原受体(TCR)、IL-4R信号途径启动，主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子。IL-4通过Th2细胞特异性转录因子(GATA)3的活化促进Th2细胞扩增，进而抑制Th1细胞分化及TNF-α、IFN-γ等细胞因子的分泌，发挥抗炎作用。在RA的发病过程中，IL-4、IL-5等细胞因子的分泌可以改善RA的慢性关节炎症及骨、软骨的破坏。研究显示IL-4可以通过抑制Smad3对转化生长因子(TGF)-β受体的影响进而抑制Th17细胞的分化，起到抗RA炎症进展的作用〔12〕。T淋巴细胞在体外一般处于静息状态，无法增殖，本研究在体外加入了IL-2及Ⅱ型胶原作为刺激剂，诱导T淋巴细胞的增殖，建立CIA体外细胞模型。研究显示Ⅱ型胶原在体外能够刺激CIA模型的T淋巴细胞增殖，IL-2是体内重要的T细胞生长因子，能促进T淋巴细胞增殖，两者体外联合刺激可以有效活化CIA鼠T淋巴细胞〔13〕。

本研究说明IFN-γ、TNF-α参与了RA的发病。薯蓣皂苷元作用后，可以抑制IFN-γ及TNF-α的分泌，说明薯蓣在体内可能通过其代谢产物薯蓣皂苷元对Th1 型细胞因子产生抑制作用，对RA的病情缓解产生有益的作用。IL-2及Ⅱ型胶原刺激CIA鼠T淋巴细胞后IL-4水平显著升高，而IL-5水平显著下降，说明可能是在特异性抗原的作用下Th2型细胞因子一过性反应增高，经薯蓣皂苷元作用后，IL-4、IL-5水平明显上升进而拮抗IFN-γ、TNF-α升高，发挥抗炎作用。