姜黄素对结肠癌细胞Caco2中MACC-1及PGE2的影响

贾 佳 赵 逵 陈 涛

(湖北医药学院附属人民医院，湖北 十堰 470000)

姜黄素及其衍生物的抗肿瘤作用发展前景无限。结肠癌是我国的常见的消化道肿瘤之一。结肠癌转移相关因子(MACC-1)是一个新的癌基因，通过全基因细胞分析被Stein等〔1〕研究者发现，在胃癌〔2〕、肝癌〔3〕、胰腺癌〔4〕、子宫内膜癌〔5〕、食管癌〔6〕等的发生、发展及转移起到至关重要的作用。MACC-1是肝细胞生长因子(HGF)激活配体的原癌基因，并且能够调控HGF受体(c-Met)所介导的信号通路成为该通路的关键调控因素。前列腺素(PG)E2，是花生四烯酸转化的生物活性物质，在许多肿瘤的原发灶、转移灶中高表达，尤其在结肠癌中表达更为突出。本实验研究姜黄素对结肠癌细胞Caco2增殖及对MACC-1及PGE2蛋白表达的影响。

1 材料和方法

1.1药物和试剂 姜黄素、MTT(Sigma公司)；胎牛血清、改良型1640培养基、胰蛋白酶(Hylone公司)；DMSO(贵阳恒因生物)；兔抗人多克隆MACC-1(Abcam公司)，β-actin引物、大鼠抗人多克隆c-Met抗体(Santa Cruz 公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、辣根酶标记鼠抗兔IgG(H+L) (北京博奥森生物技术有限公司)；β-actin多克隆抗体(小鼠来源)、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L) (北京中杉金桥公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人结肠癌细胞株Caco2购自中科院上海细胞所，细胞培养：结肠癌细胞Caco2，接种于含10%胎牛血清改良型1640培养基中培养，置于37℃、5%CO2、100%湿度培养箱中培养，隔天换液，待细胞长至对数生长期时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2.2MTT法检测姜黄素对Caco2细胞增殖的抑制 取对数生长期的Caco2 细胞，设空白组、对照组、姜黄素组，调整细胞浓度为2.0×106个/ml，接种于96孔板中，分别加入5、10、20、40、60、80、100、120 μmol/L，设5个复孔，对照组加入培养基，培养48 h，每孔加入20 μl 0.5%的MTT 溶液，继续培养4 h，每孔加入150 μl DMSO，低速振荡10 min，酶标仪读取A490 值，计算出半数致死量(IC50)。

1.2.3ELISA检测PGE2 取对数生长期细胞，按5×104个/孔，每孔500 μl培养液，分别接种于24孔板中，培养24 h贴壁后，加入 48 μmol/L姜黄素，每个时间点均设对照组，培养箱中培养，于6、12、24、48 h取上清入灭菌过的EP管中，取上清液100 μl/孔按ELISA试剂盒操作说明书进行实验，每个样品设复孔。

1.2.4Western印迹法检测Caco2细胞中c-Met与MACC-1 蛋白的表达 用48 μmol/L姜黄素处理Caco2细胞，培养6、12、24和48 h，并设阴性对照，提取总蛋白后，再用BCA定量试剂盒进行总蛋白定量，样品20 μl上样，加入缓冲液电泳，转膜，再封闭，加一抗杂交(c-Met与MACC-1、β-actin)及相应二抗，暗盒中曝光后进行显影和定影，用凝胶图像分析系统对结果进行分析。

1.3统计学方法 采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1不同药物浓度对人结肠癌细胞Caco2增殖的影响 同对照组比较，随着姜黄素浓度增加，OD值随之显著降低，存在量效关系(P<0.05)，并测得姜黄素对Caco2细胞的IC50为49.5 μmol/L，见图1。

2.2不同时点细胞上清液PGE2水平 对照组随时间的延长，上清液中PGE2水平不断增加，加入48 μmol/L姜黄素干预后，上清液中PGE2水平明显下降，与同时点对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

图1 不同浓度姜黄素对Caco2细胞48 h生长增殖的影响

组别6 h12 h24 h对照组61.934 9285.391 08170.117 60姜黄素组23.283 201)31.338 851)45.178 651)

与同时点对照组比较：1)P<0.05

2.3姜黄素对Caco2细胞中c-Met与MACC-1蛋白表达的影响 姜黄素浓度48 μmol/L干预Caco2细胞6、12、24和48 h时c-Met与MACC-1蛋白均较对照组表达逐渐降低(图2)，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，见表2。

图2 姜黄素对Caco2细胞中MACC-1及c-Met蛋白表达的影响

组别MACC-1c-Met对照组0.924 0±0.147 70.714±0.065姜黄素6 h组0.686 8±0.111 51)0.614±0.0551)姜黄素12 h组0.476 3±0.171 51)0.584±0.0351)姜黄素24 h组0.281 8±0.130 81)0.367±0.0351)姜黄素48 h组0.092 0±0.044 72)0.125±0.0352)

与同时点对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01

3 讨 论

姜黄素联合维生素C，对胃肿瘤细胞SGC-7901周期 有明显的抑制作用〔7〕。张建中等〔8〕研究显示姜黄素对胃肿瘤细胞SGC-7901的抑制作用可能是通过抑制IKK途径降低IκBα的降解从而抑制核因子(NF)-κB通路的激活。化疗药物能够杀灭肿瘤，但对正常的细胞也具有杀伤作用，所以在抗肿瘤的治疗中尽量减少化疗药物的用量。本实验证实，姜黄素能够抑制体外结肠癌Caco2细胞的增殖，呈剂量依赖性，随着剂量的增加，肿瘤细胞明显被抑制。PGE2 能促进细胞的增殖、分化，也能促进肿瘤血管的形成，抑制肿瘤细胞凋亡，抑制有免疫调节功能的淋巴因子产生，抑制T细胞、B细胞的增殖、肿瘤坏死因子(TNF)的产生；可诱导白细胞介素(IL)-10产生〔9～11〕。因此，应用环氧化酶抑制剂姜黄素可减轻肿瘤引起的免疫抑制作用及PGE2蛋白表达的下降，说明姜黄素有可能抑制了TNF-α，这与相关研究〔12〕结果一致，PGE2对肿瘤坏死因子具有抑制作用。PGE2是脂质信号分子发挥着各种功能，如发热、血管扩张、子宫收缩、刺激成骨细胞的吸收等一系列作用，研究显示〔13〕15-羟基前列腺素脱氢酶(15-PDGH)是PGE2生物活性氧化酶，能够绑定PG因子，促进造血干细胞的改善、炎症恢复。研究显示〔14〕在结肠癌LOVO中，PGE2能上调β-catenin和VEGF的蛋白表达，从而激活wnt信号通路，而PGE2抑制wnt/β-catenin时，VEGF的表达无异常，说明PGE2对VEGF的调节可能是通过另一途径。本实验结果说明姜黄素能够降低PGE2的含量，可能是通过抑制wnt/β-catenin等信号通路。MACC-1是HGF和c-Met信号通路的重要调控者，在原位癌、转移灶等恶性肿瘤中高度表达，促进肿瘤的发展、抑制凋亡，而在正常组织中不表达或低表达〔15〕。研究显示，MACC-1能够控制Met启动子的活性和表达，MACC-1转染后能够诱导Met表达；MACC-1 siRNA 治疗后导致Met 基因被敲除〔1，3〕。研究显示〔16〕，在胃癌细胞中MACC-1能够促进肿瘤的增殖、转移和侵袭，以研究显示〔17～19〕评估胃癌患者MACC-1预后的重要性存在冲突，包括阴性及预后不良的影响。研究显示〔16〕，胃癌患者中MACC-1和Met蛋白过度表达与两者低表达相比较显示出低生存率，然而，其他研究显示〔20〕这两组在生存率上无差异。而显示，MACC-1与总生存率及无事件生存率的相关性是独立的，而Met与上述指标不相关，也支持一项假说——在进展期的胃癌患者起重要作用的是MACC-1信号通路，因此，这项研究显示在胃癌组织中MACC-1表达是临床预后的不利因素，而不是Met，尽管Met是MACC-1众所周知的靶基因，但结果远非如此〔21〕。本实验显示姜黄素能够抑制MACC-1及Met蛋白的表达，呈时间依赖性，可能是因为抑制MACC-1蛋白表达，从而影响了HGF/c-Met的信号通路，抑制了Caco2细胞的增殖，根据Wha等〔21〕研究结果可以推断，抑制MACC-1蛋白比抑制Met蛋白更有利于结肠癌患者的预后。MACC-1可作为结肠癌患者转移、生存及预后的生物标志物，在Lemos等〔22〕的实验中首次提出，MACC-1所调控的信号通路与肿瘤干细胞的相关性是通过诱导多样性干细胞标志物Nanog、Oct4实现的，因此，MACC-1能够促进肿瘤的进展及转移可能是通过干细胞的信号通路MACC-1/Nanog/Oct4轴而实现，为靶向性及干预治疗提供了新的选择。

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