通络玉液汤对2型糖尿病心肌病大鼠心功能及心肌纤维化的影响

李淑贞 杨艳梅 杨晓晖 崔茂香

(沧州医学高等专科学校,河北 沧州 061001)

最新数据〔1〕显示，中国成年人糖尿病患病率高达11.6%，由此推测目前中国有1.139亿糖尿病患者，其中2型糖尿病(T2DM)患者占糖尿病总数的90%～95%。糖尿病心肌病(DC)是糖尿病所致心血管系统损害的重要并发症之一，可引起糖尿病患者心功能下降，最终导致充血性心力衰竭、心源性休克及猝死，与糖尿病患者心血管事件的高发生率和高死亡率密切相关〔2〕。研究证实转化生长因子(TGF)-β1是一种多功能生长因子，在DC发病中具有重要作用。通络玉液汤是在玉液汤、生脉散原方基础上加减化裁而成，具有益气养阴、活血通络之效。本实验通过心功能和TGF-β1等指标的观察，探讨通络玉液汤对DC大鼠的治疗作用及其可能机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 通络玉液汤(生晒参、生黄芪、生山药、麦冬、知母、花粉、葛根、五味子、鸡内金等)中药饮片均购自沧州同仁堂药店。浸泡、煎煮、浓缩成2.5 g生药/ml的液体；链脲佐菌素(STZ)购自美国 Sigma 公司。TRIZON 购自新西兰Invitrogen公司，RNA逆转录试剂盒购自 TIANGEN生化科技(北京)有限公司，SYBR Green 实时荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa大连宝生物工程有限公司。

1.2模型建立与药物干预 SPF级48只健康雄性SD大鼠 〔中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心提供，合格证号：SCXK-(军)2009-003〕，体重 150～180 g。适应性喂养1 w后，参考董世芬等〔3〕方法，并根据预实验结果，分为正常对照组(NC组) 和模型组。模型组先用高脂高糖饲料(20%蔗糖、10%猪油、2.5%胆固醇和67.5%基础饲料)喂养4 w，然后一次性腹腔注射1% STZ 30 mg/kg，72 h后测大鼠空腹血糖(FBG)，>11.1 mmol/L认为是T2DM大鼠模型成功，持续高脂高糖饲料喂养6 w，即成DC模型。NC组一直采用基础饲料喂养，等量枸橼酸钠缓冲液(pH4.4)代替STZ腹腔注射，不采血。选择成模大鼠36只随机分为3组：DC组，苯那普利阳性药物对照组(BP组)，通络玉液汤组(TYD组)。TYD组灌服通络玉液汤煎剂25 g·kg-1·d-1；BP组灌服苯那普利 1 mg·kg-1·d-1；NC组和DC组每日灌服相应剂量的生理盐水，连续8 w。

1.3左心室功能检测 实验结束各组10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉，备皮仰卧位固定，进行彩色多普勒超声心动图检查。二维超声测量：左心室收缩末期内径(LVISD)、左心室舒张末期内径(LVIDD)及射血分数(EF)，短轴缩短率(FS)。

1.4血糖及水平的测定 各组禁食不禁水12 h，由颈总动脉取血检测FBG。

1.5胶原容积分数的测定 大鼠处死后取一部分左心室心肌组织以4%多聚甲醛固定，石蜡切片，常规Masson染色，光镜下观察心肌细胞呈红色或黄色，胶原纤维呈蓝绿色，拍片，扫描，采用图像分析仪测量胶原容积分数(CVF，CVF=同一图像中胶原面积/所测视野面积)。每个切片选取5个视野取其平均数。

1.6免疫组化测定心肌组织中TGF-β1蛋白表达 石蜡切片，常规脱蜡至水，抗原修复，血清封闭，滴加一抗，4℃冰箱过夜，滴加二抗，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。阳性判定标准：以细胞质被染成棕褐色为阳性结果。每组标本切片随机选取10个高倍视野，借助于HPIAS2000多媒体彩色病理图像分析系统测定各组切片阳性颗粒的平均灰度值反映TGF-β1的表达水平。

1.7实时定量RT-PCR测定心肌组织中TGF-β1 mRNA的表达 ①RNA提取与cDNA的合成：取100 mg心肌组织，加入Trizol 1 ml，冰浴匀浆，提取总RNA，紫外分光光度计测定RNA纯度与浓度，电泳法检测其完整性；取0.5 μg总RNA反转录cDNA。②实时荧光定量PCR：按照 RT-PCR试剂盒说明书进行RT-PCR 检测。以β-actin为内参，引物设计TGF-β1：正义5′-GCCTGAGTGGCTGTCTTTTGA-3′，反义5′-GGAAGGGTC-GGTTCATGTCAT-3′，扩增片段长度为330 bp；β-actin的引物：正义5′-ATATCgCTgCgCTCgTCgT-3′，反义5′-TCTCTTGCTCTGGGCCTCGT-3′。PCR的反应条件：预变性95℃ 60 s；变性95℃ 10 s；58℃退火20 s；72℃延伸20 s，40个循环。引物均由上海赛百盛基因技术有限公司合成。以β-actin为内参，采用ΔCt(ΔCt目的-ΔCt内参)法进行相对定量分析，以2-ΔCt作为目的 RNA 的相对表达量。

1.8统计学方法 采用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1TYD对DC大鼠血糖的影响 与NC组〔(5.82±1.12)mmol/L〕比较，DC组FBG〔(24.33±3.74)mmol/L〕明显升高(P<0.01)；经用药干预后，各治疗组FBG明显降低，与DC组比较，TYD组〔(10.42±2.52)mmol/L〕差异有统计学意义(P<0.01)，BP组〔(23.98 ±4.09)mmol/L〕差异无统计学意义；与BP组比较，TYD组FBG明显降低(P<0.01)。

2.2TYD对DC大鼠左心室功能的影响 与NC组比较，DC组LVISD及 LVIDD明显增大(P<0.01)，EF和FS明显下降(P<0.05)；经用药干预后，各治疗组LVISD及 LVIDD显著降低，EF和FS显著升高，与DC组比较LVISD、EF和FS差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，但BP组和TYD组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1，图1。

表1 各组心功能的比较

与NC组相比：1)P<0.01，2)P<0.05；与DC相比：3)P<0.01，4)P<0.05

图1 各组心功能超声心动图结果

2.3Masson染色观察各组胶原表达情况 光镜下：NC组心肌纤维完整，细胞形态规则，胶原纤维主要分布在血管周围，心肌细胞间有少量的胶原纤维，着色淡；DC组心肌纤维排列紊乱，心肌间隙增宽，有大量纵横交错的胶原纤维，排列紊乱，分布不匀；BP组和TYD组心肌肌纤维排列基本规则，胶原纤维量要明显少于DC组，尤以TYD组显著。见图2。与NC组(7.38±1.81)%比较，DC组CVF值(28.95±7.35)% 显著升高(P<0.01)；经用药干预后，各治疗组CVF值降低，与DC组差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)；TYD组CVF值(18.73±5.10)% 小于BP组(23.07±6.33)%，但两者差异无统计学意义。

2.4大鼠心肌组织TGF-β1基因、蛋白的表达 免疫组化结果：NC组心肌细胞胞质内可见少许黄色染色颗粒，TGF-β1无或微量表达；DC组TGF-β1大量表达，部分心肌细胞内呈弥漫性强染色；BP组和TYD组心肌细胞内免疫复合物染色范围及强度均较轻，TGF-β1少量表达，以TYD组最为明显。定量分析：与NC组比较，DC组TGF-β1平均灰度值显著降低(即TGF-β1蛋白表达显著增强，P<0.01)；经用药干预后，治疗组TGF-β1平均灰度值明显升高(即TGF-β1蛋白表达减弱)，与DC组相比差异有统计学意义(P<0.05)；与BP组比较，TYD组TGF-β1平均灰度值升高，但二者差异无统计学意义。见图3。实时荧光定量RT-PCR检测结果：与NC组比较，DC组TGF-β1的mRNA表达水平显著升高(P<0.01)；经用药干预后，各治疗组TGF-β1的mRNA表达水平较DC组显著下降(P<0.01)。与BP组比较，TYD组TGF-β1的mRNA表达水平明显下降(P<0.05)。见表2。

图2 各组心肌组织Masson染色(×400)

图3 各组心肌组织TGF-β1免疫组化(×400)

组别TGF-β1蛋白TGF-β1 mRNANC120.59±10.020.016 89±0.004 0DC96.44±10.061) 0.165 31±0.057 51)BP105.66±6.783)0.106 00±0.026 72)TYD107.38±7.653) 0.062 67±0.021 72)4)

与NC组相比：1)P<0.01；与DC组相比：2)P<0.01，3)P<0.05；与BP组相比：4)P<0.05

3 讨 论

DC作为一种特异的糖尿病心血管并发症，是一种独立于冠心病、高血压、先心病和其他种类的心脏病之外的特异心脏病变，与糖尿病患者心力衰竭的高发生率和高死亡率密切相关〔4〕。DC的主要病理变化是心肌间质纤维化，从而增加室壁的僵硬度，降低心室顺应性，导致心脏舒张与收缩功能障碍，最终引发心力衰竭。研究发现〔5～7〕，TGF-β1是一种多功能细胞因子，在调节细胞外基质的形成中起重要作用，是体内重要的促纤维化细胞因子，与糖尿病患者的心肌纤维化密切相关：①持续高血糖可直接刺激TGF-β1表达，引起心肌成纤维细胞分泌胶原，加速心肌纤维化；②高血糖引发的氧化应激可通过增加核因子(NF)-κB进入细胞核使得TGF-β1转录增多，从而刺激Ⅰ型和Ⅲ型胶原合成，引起心肌纤维化；③高糖状态下，心肌经过磷脂肌醇信号PKc途径使肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)被激活，血管紧张素(Ang)Ⅱ表达增多，刺激心肌成纤维细胞中的TGF-β1分泌增多，促进Ⅰ型、Ⅲ型胶原合成增加、分解减少，最终造成心肌肥厚及心肌纤维化。因此，抑制心肌组织中TGF-β1的高表达成为DC治疗的靶标。

本实验表明心脏收缩舒张及射血功能明显降低；DC与高血糖状态下的TGF-β1高表达有关，与文献报道相符〔8〕。本实验说明通络玉液汤可有效降低血糖，并通过降低TGF-β1的表达来减轻DC心肌损伤，改善心功能，对DC大鼠心脏起明显的保护作用。

4 参考文献

1Xu Y，Wang L，He J，etal.Prevalence and control of diabetes in Chinese adults〔J〕.JAMA，2013；310(9)：948-59.

2黄娅茜，王 宪，孔 炜.糖尿病心肌病发病机制的研究进展〔J〕.生理科学进展，2010；41(1)：31-6.

3董世芬，洪 缨，樊江波，等.实验性2型糖尿病心肌病大鼠模型的建立与评价〔J〕.中国实验动物学报，2009；17(4)：245-51.

4Battiprolu PK，Lopez-Crisosto C，Wang ZV，etal.Diabetic cardiomyopathy and metabolic remodeling of the heart〔J〕.Life Sci，2013；92(11)：609-15.

5陈铭林，吴 铿.TGF-β1对糖尿病心肌病的影响〔J〕.临床医学工程，2014；21(2)：261-4.

6Chen H，Yu B，Lu C，etal.The effect of intra-articular injection of different concentrations of ozone on the level of TNF-α，TNF-R1，and TNF-R2 in rats with rheumatoid arthritis〔J〕.Rheumatol Int，2013；33(5)：1223-7.

7Malemud CJ.Anticytokine therapy for osteoarthritis：evidence to date〔J〕.Drugs Aging，2010；27(2)：95-115.

8Ma YX，Li WH，Xie Q.Rosuvastatin inhibits TGF-beta1 expression and alleviates myocardial fibrosis in diabetic rats〔J〕.Die Pharmazie，2013；68(5)：355-8.