野葛叶提取物体内、外抗衰老活性

2018-07-18王翰华杨晓春倪梦茜

中国老年学杂志 2018年13期

王翰华杨晓春倪梦茜

(浙江医药高等专科学校，浙江宁波 315100)

野葛是豆科葛属多年生草质藤本植物〔1〕，我国大部分地区均有分布。葛根是一味传统的药食同源中药，具有保护心脏、降血压、抗凋亡、降血糖、防治骨质疏松、保护神经、抗氧化和治疗神经病理性疼痛等多种活性〔2〕。葛花性味甘、辛、凉，入脾、胃经，有和味解酒、生津止渴之功效。目前对葛根〔2〕和葛花〔3〕的研究已较为全面，但有关野葛叶的研究相对匮乏〔4〕。野葛叶提取物具有防治去卵巢大鼠骨质疏松的作用〔5〕。本研究观察野葛叶提取物体内、外抗衰老活性。

1 材料和方法

1.1主要仪器 FS300Y-3型高速粉碎机(广州雷迈机械设备有限公司)；DZKW-D-4电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)；JD-500小鼠避暗仪(上海继德教学实验器械厂)；TGL-20高速冷冻离心机(四川蜀科仪器有限公司)；凝胶成像分析系统和酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；TU-1818型紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.2材料与试剂野葛叶购于安徽省亳州市药材市场，经浙江医药高等专科学校中药学院鉴定为豆科植物野葛的叶。D-半乳糖(D-gal)(江苏鹏翔生物医药有限公司)；维生素(Vit)E(浙江医药股份有限公司，批号160339)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒(南京建成生物研究所)；二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基、超氧阴离子自由基、2，2-聚氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基(美国Sigma公司)。试剂均为分析纯或化学纯。

1.3野葛叶提取物的制备取野葛叶粉末1 000 g，加4倍量60%乙醇，浸渍2 h，80℃水浴回流2.5 h，减压浓缩至浸膏，冷冻干燥，得野葛叶提取物粉末，于4℃下保存，临用时加蒸馏水配制成所需浓度的溶液。

1.4实验动物昆明种小鼠，体质量20～25 g，雌雄各半，由浙江大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK(浙)2012-0178。

1.5体内试验

1.5.1动物分组、造模及给药小鼠适应性饲养1 w后，随机分成6组，每组10只，分别为：空白对照组、衰老模型组、VE对照组(50 mg/kg)和野葛叶提取物低(100 mg/kg)、中(200 mg/kg)、高(400 mg/kg)剂量组。除空白对照组外，其他组参考文献〔6，7〕的方法造模。将D-gal溶于生理盐水，体积分数10%，颈背部皮下注射(剂量15 ml/kg)，连续6 w，空白对照组注射等体积生理盐水。同时，VE对照组和野葛叶提取物各组按15 ml/kg，灌胃给药，空白对照组和衰老模型组灌胃等体积生理盐水。6 w后，小鼠摘眼球取血处死，分离血清，快速摘取肝脏和脑组织，进行新鲜组织匀浆，与预冷的生理盐水混合，打匀4～5次后，1 000 r/min离心10 min，取上清液，-70℃保存备用。

1.5.2一般行为学观察每日观察小鼠的毛色、日常活动、进食和精神等情况；每周称取小鼠体质量。

1.5.3学习记忆能力测试(避暗实验) 参考文献〔8〕，在实验开始的第5周进行避暗实验。实验前将小鼠头背着洞口放入明室3 min，给暗室铜栅通电(36 V)，小鼠进入暗室即受电击退回明室，如此训练5 min。24 h后实验，记录小鼠第1次进入暗室的时间(避暗潜伏期)及5 min内小鼠进入暗室的次数(避暗错误次数)。

1.5.4SOD活性、MDA含量和GSH-Px活性的测定取小鼠血清及10%组织匀浆，照试剂盒说明书测定，重复3次，取平均值。

1.6体外实验

1.6.1清除DPPH自由基测定取4.0 ml不同质量浓度的野葛叶提取液，参考文献方法〔9〕配制待测液，于517 nm处测定吸光度A，平行3份。清除率(%)=〔1-(A-A0)/A1)〕×100%。其中A为野葛叶提取液与DPPH自由基混合溶液吸光度，A0为野葛叶提取液本身吸光度，A1为DPPH自由基溶液吸光度。

1.6.2清除超氧阴离子自由基测定采用经典的邻苯三酚自氧化法〔9〕。取 0.5 ml不同浓度的野葛叶提取液配制成待测液，于310 nm处测定A，平行3份。清除率(%)=〔1-(A1-A2)/A0〕×100%。其中A0为野葛叶提取液吸光度，A1为只加邻苯三酚吸光度；A2为野葛叶提取液与邻苯三酚混合溶液吸光度。

1.6.3清除ABTS自由基测定参考文献方法〔9〕，取不同浓度的野葛叶提取液2.0 ml，配制成待测液，于740 nm处测定A，平行3份。清除率(%)=〔1-(A-A0)/A1〕×100%。其中A为野葛叶提取液与ABTS自由基混合溶液吸光度，A0为野葛叶提取液吸光度，A1为ABTS自由基溶液吸光度。

1.6.4还原性测定采用经典普鲁士法〔10〕。取2.0 ml不同浓度的野葛叶提取液，配制成供试液，于740 nm处测定吸光度A，A值与还原性呈正比。

1.7统计学处理采用SPSS18.0软件行方差分析。

2 结果

2.1体内试验结果

2.1.1对一般行为学的影响造模前各组毛发光亮，反应灵敏，行动敏捷，饮食正常。随着造模的进行，衰老模型组与空白对照组比较毛发暗淡，反应迟钝，嗜睡，进食减少，体质量增长缓慢甚至减轻。同衰老模型组比较，VE对照组及野葛叶提取物各组上述症状都得到了不同程度的减轻。

2.1.2对学习记忆能力的影响训练时，衰老模型组较空白对照组5 min内错误数显著增多(P<0.05)，野葛叶提取物低、中、高剂量组及VE对照组较衰老模型组5 min内错误数显著减少(P<0.05)。测试中，与空白对照组相比，衰老模型组5 min内的错误数极显著增多(P<0.01)，表明造模成功；野葛叶提取物各组及VE组较衰老模型组能明显减少错误数(P<0.01)，且能极显著增加避暗潜伏期(P<0.01)。提示野葛叶提取物能够抵抗或恢复D-gal对小鼠学习记忆能力的损伤。见表1。

表1 各组记忆能力比较

与空白对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与衰老模型组比较：3)P<0.05，4)P<0.01，下表同

2.1.3对血清、肝脏及脑组织中SOD、MDA和GSH-Px活性的影响与空白对照组比较，衰老模型组血清、肝脏及脑组织中SOD活性及GSH-Px活性均显著降低(P<0.05，P<0.01)，MDA含量明显增加(P<0.01)；与衰老模型组比较，VE对照组和野葛叶提取物各组血清、肝脏及脑组织中SOD和GSH-Px活性均有显著提高，MDA含量显著降低、差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见表2。表明野葛叶提取物抗衰老的机制可能与增加SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量有关。

表2 各组血清、肝脏及脑组织中SOD、MDA 和GSH-Px活性比较

2.2体外试验结果

2.2.1对DPPH自由基的清除野葛叶提取物质量浓度为25～400 μg/ml，对DPPH自由基清除率呈浓度依赖性，当质量浓度超过400 μg/ml时，清除率趋于平稳。见图1。

2.2.2对超氧阴离子自由基的清除野葛叶提取物质量浓度为25～300 μg/ml，对超氧阴离子自由基清除率呈浓度依赖性，当质量浓度超过300 μg/ml时，清除率趋于平稳。见图1。

2.2.3对ABTS自由基的清除野葛叶提取物质量浓度为25～400 μg/ml，对ABTS自由基的清除率呈浓度依赖性，当质量浓度超过400 μg/ml时，清除率趋于平稳。见图1。

2.2.4野葛叶提取物的还原力野葛叶提取物质量浓度为25～400 μg/ml，还原力随浓度增加而显著增强，达到400 μg/ml后，还原力逐渐平稳。见图1。

图1 对DPPH、超氧阴离子、ABTS自由基和野葛叶提取物还原子的清除作用

3 讨论

衰老是机体各器官、组织功能随年龄增长而发生退行性变化的过程〔11〕。D-gal致衰老模型中，D-gal在半乳糖氧化酶催化下，产生超氧阴离子自由基，从而导致衰老反应〔12〕。研究发现，过量的自由基是引起机体衰老的主要因素〔13，14〕。本研究通过体内、外实验表明，野葛叶提取物具有抗衰老作用，这可能与其直接或间接清除自由基，避免了因抗氧化性物质消耗而导致机体衰老有关。本实验使用60%乙醇作为提取溶剂，其提取物包含野葛叶绝大部分成分。接下来，可对其不同极性部位进行药效学评价，筛选活性部位进行化学成分信息表征，并对其作用机制进行阐释与验证。对野葛叶的进步开发利用，可以扩大野葛的药用部位，逐渐代替葛根药用，利于药源再生。