胃癌患者血浆miRNA-21的表达水平及意义

姜 雷 代 强 梁晓磊 关泉林 赵 鹏 汪晓炜

(兰州大学第一医院肿瘤外科，甘肃 兰州 730000)

胃癌已成为一类严重危害我国人民健康的疾病〔1〕。胃癌的发病原因尚未完全明了，多数学者认为是环境与基因交互作用的结果。miRNA是一类分布广泛的小的非编码蛋白质的RNAs，其功能是调控基因表达，在肿瘤中发挥着相当于癌基因或抑癌基因的作用，调节着肿瘤细胞的多种重要生物学行为〔2〕。研究表明miRNA-21在胃癌患者的组织中高表达〔3〕，现有研究已证实外周血和组织来源的miRNA的表达谱是一样的，提示检测血浆中的miRNA有望成为诊断和判断恶性肿瘤预后的非损伤性分子标志物〔4〕。本研究将采用qRT-PCR的方法检测胃癌患者和健康人群血浆中miRNA-21的表达量，探讨其表达量与胃癌临床病理特征的相关性及诊断胃癌的准确性。

1 资料与方法

1.1病例及标本 收集兰州大学第一医院肿瘤外科2014年6月至2015年6月期间胃癌患者的血浆标本共59例，同时收集44例健康对照者血浆标本。所有胃癌病例均有详细的临床病理资料，所有标本经病理学检查明确诊断为胃癌。所有的胃癌患者手术前未接受化疗、放疗、生物治疗等其他治疗。胃癌患者和健康对照人群在年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。血浆标本制作流程：抽取外周血5 ml置于含EDTA 抗凝的取血管中，静置30 min，4℃下1 300 r/min离心15 min，取上层澄清血浆至另一RNAse-free Eppendorf管，10 000 r/min 离心15 min 后取上层血浆每300 μl 分装至RNAse-free Eppendorf 管，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存，同时收集患者的临床病理资料。

1.2实验方法 采用Trizol (Invitrogen)提取胃癌患者血浆中的总RNA。采用天根FastQuant RT Kit逆转录，qRT-PCR法定量miRNA-21，以U6 miRNA作为对照。miRNA-21引物：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA；U6引物：CTCGCTTCGGCAGCACA。使用miRcute 增强型miRNA 荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)和其通用反向引物。各样本的△Ct 值=(目的基因 Ct值-内参基因Ct值)，以U6为内参基因，各样本基因表达相对定量值为2-△Ct。

1.3统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行配对t检验，相关性采用Wilcoxon 秩和检验。

2 结 果

2.1miRNA-21在胃癌患者及健康对照者血浆中的表达量 miRNA-21在胃癌患者血浆中的相对表达量为30.041±4.214，明显高于健康对照者(27.993±4.488，P=0.014)。

2.2miRNA-21血浆表达水平与胃癌患者临床病理特征的相关性 胃癌患者miRNA-21血浆表达水平与胃癌患者的性别(P=0.437)、年龄(P=0.982)、分化程度(P=0.082)、TNM分期(P=0.402)、浸润深度(P=0.658)及肿瘤大小(P=0.255)无明显的相关性；而与淋巴结转移明显相关(P=0.010)。见表1。

2.3血浆miRNA-21的表达水平诊断胃癌的准确性 曲线下的面积(AUC)=0.641，95%CI(0.531～0.751)，敏感度为52.5%，特异度为75%，提示血浆miRNA-21的表达水平诊断胃癌具有较好的准确性，见图1。

表1 miRNA-21的表达水平与胃癌患者临床病理特征的相关性

图1 血浆miRNA-21的表达水平诊断胃癌的准确性

3 讨 论

miRNA-21是一种与恶性肿瘤相关的miRNAs，主要参与基因的表达调控，是唯一在所有恶性肿瘤均高表达的miRNAs〔5〕。但是既往研究对胃癌miRNA-21的研究主要集中在肿瘤组织或肿瘤细胞，组织活检或是切片属于创伤性检查，而血液标本采集为非创伤性检查手段，更符合机体的生理病理状况，有助于动态监测机体的病情变化。外周血miRNA的表达谱可构成识别癌症与其他疾病的“指纹”，可用于肿瘤的筛查诊断、分型分类、疗效预测及预后判断等领域〔6〕。本研究表明胃癌患者血浆中miRNA-21的表达量高于健康人群，用于胃癌的早期诊断。加之血浆中的miRNA还非常稳定，检测方法简单、定量准确、标本采集方便、检测成本低廉，有很大的临床应用前景。

Zhang等〔7〕用实时定量PCR 方法证实了miRNA-21 在人胃癌组织及细胞株中显著高表达，miRNA-21高表达会显著增强胃癌细胞的增殖和侵袭能力，而敲除miRNA-21会导致细胞凋亡显著增加，增殖、侵袭和迁移能力会明显下降，RECK基因可能是miRNA-21基因的作用靶点，体外实验还发现抑制miRNA-21的表达可以增加抑癌基因PTEN的表达，降低肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭能力，而增强miRNA-21的表达则产生相反的效果〔8〕，而且PTEN mRNA的3′-UTR区存在miRNA-21的直接结合位点，miRNA-21通过与之结合，在转录后水平调节PTEN的表达，参与多种疾病的发生发展〔9〕。一项动物实验探讨了miRNA-21在淋巴瘤发生中的作用，发现miRNA-21高表达的小鼠约半数3个月后表现出淋巴瘤的特征，对照组却没有此现象，当降低miRNA-21的表达水平后，表现为淋巴瘤的小鼠肿瘤逐渐退化，仍然存活了3个月，该试验表明miRNA-21在肿瘤的发生、发展中发挥着重要的作用，提示抑制miRNA-21可能会成为肿瘤治疗的一种新方法〔10〕。

有研究表明miRNA-21还可能是预测恶性肿瘤患者生存时间的分子标志物，通过检测舌鳞状细胞癌患者miRNA-21的表达与临床特征的关系，发现高表达的miRNA-21意味着不良预后〔11〕。Gao等〔12〕学者的研究也表明：血浆和组织中miRNA-21的表达水平可以预测肺癌辅助化疗的疗效，miRNA-21还可以用来预测该类患者的无疾病复发生存时间。Jiang等〔13〕学者的研究也表明miRNA-21还可能是预测晚期胃癌患者预后较好的分子标记物，miRNA-21表达水平较低的患者往往总生存时间较长。本研究表达血浆miRNA-21的高表达，与淋巴结的转移相关。Motoyama等〔14〕对49例胃癌患者的肿瘤组织检测发现 miRNA-21的表达与肿瘤大小和浸润深度相关，而Wu等〔15〕的研究却表明miRNA-21 的表达水平与胃癌患者的临床病理分期、淋巴结转移、分化程度无相关性。因此血浆 miR-21 的表达水平与胃癌患者临床病理特征之间的相关性尚待大样本的临床研究进一步证实。Tsujiura等〔16〕研究结果显示：miRNA-21的表达量诊断胃癌的敏感度为60.9%，特异度为63.3%，AUC为0.673；一篇meta分析也定量评价了miRNA-21的表达水平诊断胃癌的准确性，该研究共纳入了5篇病例对照试验，meta分析合并后结果显示，miRNA-21的表达量诊断胃癌的敏感度为66.5%，特异度为83.1%〔17〕；Wu等〔15〕学者比较了miRNA-21、CA199和CEA诊断胃癌的准确度，结果提示三种分子标志物诊断胃癌的敏感度和特异度分别为：81.3%、73.4%，60.5%、55.9%，68.6%、59.3%，miRNA-21的准确度似乎要优于传统的肿瘤标记物，提示miRNA-21可能会成为潜在的诊断胃癌新型分子标志物。总之，miRNA-21 在胃癌患者的血浆中表达显著上调，可能与胃癌患者的临床病理特征指标相关，参与了胃癌的发生发展过程，有望成为潜在的肿瘤标志物和治疗靶点。

4 参考文献

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7Zhang Z，Li Z，Gao C，etal.miR-21 plays a pivotal role in gastric cancer pathogenesis and progression〔J〕.Lab Invest，2008；88(12)：1358-66.

8Meng F，Henson R，Wehbe-Janek H，etal.MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer〔J〕.Gastroenterology，2007；133(2)：647-58.

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