CD133、基质金属蛋白酶-2在老年结肠癌组织中的表达及其与预后的关系

徐　磊，孙志超

(连云港市第二人民医院病理科，江苏 连云港 222002)

结肠癌是最常见的消化道肿瘤之一，全球每年约有120万人发病，根据我国11个肿瘤登记处的调查结果，其发病率在恶性肿瘤中占第5位[1]，随着我国人口老龄化的到来，老年结肠癌的发病率呈上升趋势。肿瘤干细胞对肿瘤的发生、增殖、转移及复发有着重要作用。CD133被确认是较特异的肿瘤干细胞标志物，Kim等[2]研究发现CD133是结肠癌干细胞的重要标志物。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是Zn2+依赖性内肽酶蛋白水解酶家族,可降解细胞外基质的多种胶原成分。MMP-2是MMPs家族中的一员，其作用底物为Ⅳ型胶原，通过对Ⅳ型胶原、层粘连蛋白的降解功能，促进了肿瘤的侵袭和转移[3]。本文拟对CD133、MMP-2在老年结肠癌组织中表达情况与临床病理特征及预后的关系进行初步研究，探讨两者在老年结肠癌侵袭和转移中的作用。

1　资料与方法

1.1一般资料选取我院行根治性切除的老年结肠癌患者进行回顾性研究，纳入有完整病理学资料和随访资料的患者，排除结肠癌复发再次手术者、炎性肠病者、合并其他部位非结肠癌转移性癌者。所有入选患者均未接受过治疗，术后生存时间均大于3个月，共有67例老年结肠癌患者纳入本研究。结肠癌分期参照国际抗癌联盟(UICC)分期，组织学类型均为结肠腺癌，并取其中10例距离癌组织10 cm以上的正常肠黏膜组织作为对照。67例老年结肠癌患者中，男30例，女37例；中位年龄69(60～82)岁；肿瘤≥5 cm共47例，<5 cm共20例；高分化和中分化腺癌共48例，低分化腺癌19例；肿瘤侵犯浅、深肌层21例，累及全层及浆膜外46例；有淋巴结转移28例，无淋巴结转移39例；UICC分期为Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期37例。所有入选患者随访不少于5 a，只有确定为术后因结肠癌死亡者视为随访结束，随访中断的视为删失，中位随访时间为43个月。

1.2试剂兔抗人CD133单克隆抗体购自美国Abcam公司，鼠抗人MMP-2单克隆抗体、S-P试剂盒、DAB显色液均购自上海长岛生物技术有限公司，其中MMP-2为浓缩型抗体，工作浓度为150。

1.3方法由2位有经验的病理科医生阅片确诊，所有标本均经质量分数4%中性甲醛溶液固定(pH值7.0)，石蜡包埋，以厚度4 μm进行连续切片、烤干；将各切片在37 ℃恒温箱内过夜预温；二甲苯脱蜡；酒精水化；蒸馏水冲洗；微波抗原修复；蒸馏水新鲜配制体积分数3% H2O2，室温孵育15 min以灭活内源性过氧化物酶；滴加正常山羊血清封闭，室温孵育30 min；滴加抗体；滴加DAB显色液，镜下控制反应时间；冲洗；复染；分化；封片。采用切片组织染色后自身内对照作为阳性对照，采用PBS代替一抗孵育切片组织后的染色作为阴性对照。

1.4结果判定CD133主要表达于细胞膜，MMP-2表达于细胞质或细胞膜, 以细胞质或细胞膜出现棕黄色颗粒沉着为阳性染色。由2位病理科医生进行双盲法阅片，分别计数10个随机高倍镜(×400)视野下的阳性细胞率，并取平均值。CD133、MMP-2表达阳性细胞率≥10%为阳性，未见黄染颗粒的细胞或无论染色深浅每高倍视野细胞阳性率<10%为阴性。

1.5统计学处理采用 SPSS 22.0 行统计学处理，CD133和MMP-2的表达与老年结肠癌临床病理特征间的关系行χ2检验, 生存分析用Kaplan-Meier法, CD133和MMP-2的相关性分析采用Spearman相关分析，检验水准α=0.05。

2　结果

2.1老年结肠癌组织中CD133表达与其临床病理特征的关系67例老年结肠癌组织中CD133的阳性表达率为58.2%(39/67)，而10例正常结肠黏膜组织中未见CD133的表达。老年结肠癌组织中CD133的表达与患者性别、肿瘤大小、肿瘤分化程度、侵犯层次均无关(P>0.05)，而与淋巴结转移及UICC分期有关(P=0.004、0.007)。见表1。

2.2老年结肠癌组织中MMP-2表达与其临床病理特征的关系67例老年结肠癌组织中MMP-2的阳性表达率为70.1%(47/67)，而10例正常结肠黏膜组织中未见MMP-2的表达。老年结肠癌组织中MMP-2的表达与患者的性别、肿瘤大小、肿瘤分化程度均无关(P>0.05)，而与侵犯层次、淋巴结转移及UICC分期有关(P=0.032、0.004、0.030)。见表1。

2.3老年结肠癌组织中CD133和MMP-2表达的相关性Spearman相关性分析结果表明，老年结肠癌组织中CD133的表达和MMP-2的表达无明显相关性(r=0.042，P=0.733)。见表2。

2.4CD133和MMP-2的表达与老年结肠癌患者术后5a生存率的关系CD133阳性表达患者5 a生存率26.9%，CD133阴性表达患者5 a生存率64.9%，差异有统计学意义(P=0.030)。MMP-2阳性表达患者5 a生存率32.3%，MMP-2阴性表达患者5 a生存率80.2%，差异有统计学意义(P=0.046)。

表1　老年结肠癌组织中CD133和MMP-2的表达与临床病理特征的关系

表2　老年结肠癌组织中CD133和MMP-2蛋白表达的相互关系

注：r=0.042,P=0.733

3　讨论

结肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，术后5 a生存率约40%～70%，老年结肠癌是结肠癌患者中的一个主要患者群体，老年患者机体逐渐老化，免疫功能逐渐减弱[4]。老年人结肠癌发病率增加，且老年结肠癌的临床表现、病理特征与非老年患者不同，主要表现为：症状不典型；右侧大肠癌多见；组织学分化良好者多见。因此，老年结肠癌患者可作为独立的研究群体。本研究对CD133和MMP-2在老年结肠癌组织中的表达情况进行初步观察，探讨两者对老年结肠癌患者预后的影响。

肿瘤中存在的肿瘤干细胞参与并控制了肿瘤的发生、发展与转移。肿瘤干细胞是具有恶性增殖能力、自我更新能力以及多向分化潜能的细胞，对肿瘤的发生、发展以及转移均具有促进作用。CD133是一个含有865个氨基酸、相对分子质量约为120 000的糖蛋白，在多种肿瘤的研究[5]中发现，CD133阳性细胞具有自我更新、分化和高致瘤性等干细胞特性，因此CD133可作为结肠癌干细胞的标志物。另外，实验[6]证实CD133阳性细胞表达高水平的多药耐药基因，具有很强的药物抗性及DNA损伤修复能力，因此对化疗药物具有很强的抵抗能力。研究[7]发现CD133阳性表达的结肠癌细胞对肿瘤发展起到促进作用，且与淋巴结转移和临床分期有关，是判断结肠癌预后的参考指标。Fang等[8]报道CD133阳性表达的结肠癌患者生存时间较短，且CD133是结肠癌的独立预后因素，因此CD133表达可能成为影响结肠癌患者生存时间的重要因素，CD133已经成为结肠癌靶向治疗的新靶点。本研究发现，67例老年结肠癌组织中CD133阳性表达39例，阳性表达率为58.2%，10例正常肠黏膜组织中未检测到CD133表达，CD133在老年结肠癌组织中表达与淋巴结转移及UICC分期显著相关， CD133阳性表达的老年结肠癌患者，肿瘤的侵袭能力强，恶性程度高，发生淋巴结转移的可能性大，患者的术后生存时间短。这提示CD133阳性的肿瘤组织中含有更多的肿瘤干细胞，CD133阳性细胞在老年结肠癌组织中的表达在一定程度上能预示老年结肠癌的恶性程度及预后。

肿瘤细胞异常增殖的同时会分泌MMPs，MMPs几乎能降解细胞外基质中的各种胶原成分, 是迄今为止发现的与肿瘤浸润转移关系最为密切的一类蛋白水解酶。MMPs包括多种具有同源性结构和功能的蛋白质，其中MMP-2、MMP-9研究较为广泛。MMP-2是MMPs家族中最常见也是最重要的一种，当细胞恶变时，常伴有MMP-2的升高，MMP-2可降解细胞外基质中的各型胶原和基底膜，从而促进肿瘤细胞向周围组织扩散；MMP-2还可以释放血管内皮细胞生长因子等，诱导肿瘤血管生成；MMP-2还有调节细胞黏附的能力，降低肿瘤细胞与微环境之间的黏附力，使之更易脱落，形成远处转移[9-10]。研究[3]表明，几乎各类肿瘤细胞都存在MMP-2高表达，结肠癌组织中的MMP-2也明显高于正常结肠黏膜，通过上述机制，MMP-2可促进结肠癌细胞的快速增殖及扩散，从而严重影响结肠癌患者的生存时间。本文结果显示，67例老年结肠癌组织中MMP-2阳性表达47例，阳性率为70.1%，10例正常肠黏膜组织中未检测到MMP-2表达，MMP-2在老年结肠癌组织中表达与淋巴结转移及UICC分期显著相关，同时与肿瘤侵犯层次密切相关，这与有关文献[11]一致, MMP-2阳性表达的细胞对肿瘤的进展起促进作用，使肿瘤细胞穿透细胞外基质的能力明显增强，有利于肿瘤细胞转移，故MMP-2可作为一个反映老年结肠癌浸润、转移等恶性行为的重要指标。

总之，CD133和MMP-2均与淋巴结转移及UICC分期相关，且经Kaplan-Meier生存分析，两者阳性表达的老年结肠癌患者预后均较差，这说明CD133和MMP-2在老年结肠癌的发展过程中起到了促进作用，检测CD133和MMP-2均可作为判断老年结肠癌恶性程度及预后的参考指标。