程序性死亡受体1和程序性死亡受体配体1在食管鳞癌组织中的表达及意义

李红敏，杨海军，代宁涛，周福有

(1.河南科技大学临床医学院，河南 洛阳 471003；2.安阳市肿瘤医院，河南 安阳 455000)

食管鳞癌是影响我国人民身体健康的重要恶性肿瘤之一，流行病学调查显示，食管鳞癌发病率位于我国常见肿瘤第6位，死亡率位于第4位，男性发病率高于女性，农村高于城市[1]。我国食管鳞癌发病呈明显地域趋势，高发区发病率显著高于周边地区，在太行山沿线地区，特别是在豫北地区的林州市(林县)及其毗邻地区，食管鳞癌和贲门癌发病率占当地所有肿瘤发病率的81%,发病率显著高于相应省份。食管鳞癌早期临床症状不明显，发病隐匿，就诊时多已是中晚期，预后差，5 a生存率低。

程序性死亡受体1(programmed cell death 1，PD-1)又名CD279，属于超蛋白CD28家族成员之一，共有268个氨基酸组成，表达于T淋巴细胞的膜表面，与程序性死亡受体配体1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)结合可以抑制T淋巴细胞活化，介导肿瘤免疫逃逸。在胃癌、非小细胞肺癌、大肠癌和黑色素瘤等多种肿瘤的发生过程中均可以检测到PD-1、PD-L1的高表达[2-5]，并提示预后较差。但在小细胞肺癌中高表达PD-1、PD-L1提示预后较好[6]。本研究通过检测食管鳞癌组织中PD-1、PD-L1的表达情况，以期了解该通路与食管鳞癌发生的关系。为寻找食管鳞癌新的治疗方法和方向提供一定理论依据。

1　材料与方法

1.1一般资料选取安阳市肿瘤医院2016年7月至2017年6月间胃镜活检结果为正常的患者50例；食管不典型增生49例；术前未进行放、化疗及免疫治疗，未合并其他肿瘤和消化道疾病，术后病理确诊为食管鳞癌患者49例。所有入组对象均签署患者科研知情同意书，提交安阳市肿瘤医院伦理委员会伦理审查，审查通过后正式入组。其中食管不典型增生患者中，男30例，年龄51～77(59±5.5)岁；女19例，年龄49～76(61±5.5)岁。食管鳞癌患者中，男28例，年龄51～79(60±5.5)岁；女21例，49～77(62±5.5)岁。

1.2免疫组化染色采用免疫组化S-P法检测不同食管组织中PD-1和PD-L1，PD-1羊抗人单克隆抗体按照说明书150稀释离心(稀释液为蒸馏水)。PD-L1羊抗人单克隆抗体按照预实验结果1300稀释离心(稀释液为自制蒸馏水)，二抗即用型，均购自北京中杉金桥生物工程有限公司。组织蜡块经3 μm连续切片，烤片后脱蜡、水化；柠檬酸修复液加热2 min抗原修复；逐步滴加阻断液过氧化物酶(避光10 min)，正常非免疫动物血清封闭(室温孵育10 min)，一抗(4 ℃ 过夜)，二抗(37 ℃孵育30 min)，链霉菌抗生物素—过氧化物酶溶液(室温10 min)，DAB显色。镜下控制显色程度，水洗、复染、返蓝，脱水后中性树胶封片，镜检。

1.3结果判定PD-1、PD-L1阳性结果判定参考Bukholm等[7]制定的标准，由2位本院病理学专家采用双盲法观察切片，半定量法计算结果，每例随机观察5个高倍视野(×400)，共计数200个需观察目标细胞，计数总数及阳性细胞数：阳性细胞数≤5%为0分，>5%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分。染色强度:无色为0分，黄色为1分，黄褐色为2分，深褐色为3分。将2项积分相乘，0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为中等阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)，其中后三者均记为阳性。

1.4统计学处理采用SPSS 17.0进行统计学分析，计数资料以百分数表示，组间比较用χ2检验，两变量之间的相关性采用Spearman分析，检验水准α=0.05。

2　结果

2.1不同食管组织中PD-1、PD-L1表达的比较PD-1表达于浸润性淋巴细胞和肿瘤细胞的细胞膜上，部分细胞质中可见，PD-L1主要表达于肿瘤细胞和部分间质细胞的细胞质中(图1、2)。食管鳞癌组织中PD-1蛋白阳性率高于正常食管黏膜组织，差异有统计学意义(P<0.05)；食管鳞癌组织中PD-L1蛋白阳性率高于食管不典型增生和正常食管黏膜组织，差异均有统计学意义(P均<0.05，表1)。

图1　正常食管黏膜(A)、食管不典型增生(B)和食管鳞癌(C)组织中PD-1的表达(S-P，×400)

图2　正常食管黏膜(A)、食管不典型增生(B)和食管鳞癌(C)组织中PD-L1的表达(S-P，×400)

组织类型nPD-1阳性率/%PD-L1阳性率/%正常食管黏膜5018.020.0食管不典型增生4922.422.4食管鳞癌4936.749.0

2.2PD-1、PD-L1在食管鳞癌组织中的表达与临床病理特征的关系PD-L1的表达与食管鳞癌患者肿瘤浸润层次及TNM分期有关(P<0.05)。见表2。

表2　PD-1、PD-L1在食管鳞癌组织中的表达与临床病理特征的关系　n(%)

2.3食管鳞癌组织中PD-1、PD-L1表达的相关性PD-1和PD-L1在食管鳞癌组织中的表达无明显相关性(P>0.05)。见表3。

表3　食管鳞癌组织中PD-1和PD-L1表达的相关性　n

3　讨论

T淋巴细胞可以通过白介素家族成员等诱导PD-1激活，激活的PD-1与其配体PD-L1结合后抑制肿瘤免疫微环境，并负调控T淋巴细胞的活性和增殖能力，从而降低T淋巴细胞介导的免疫杀伤，导致肿瘤细胞免疫逃逸。这是因为PD-1是T淋巴细胞上的共抑制因子之一，与其配体PD-L1结合后细胞质区免疫受体酪氨酸转换基序结构域上的酪氨酸发生磷酸化，并通过遏制抗细胞凋亡因子Bcl-XL的表达下调白介素-2和葡萄糖代谢，诱导T淋巴细胞功能失活，负调控细胞免疫功能。因此PD-1、PD-L1的过表达可以使多种肿瘤预后变差。PD-L1是PD-1的配体之一，由PD-L1基因编码，位于9号染色体p24.1上。PD-1、PD-1通路在正常生理情况下可以维持人体自身的免疫耐受，防止过度炎症反应和自身免疫性疾病的发生，但是在病理情况下，PD-1、PD-L1在肿瘤免疫逃逸方面起到了重要作用。

我们在研究中发现，PD-1蛋白表达于T淋巴细胞和部分上皮细胞的细胞膜上，正常食管黏膜和食管不典型增生组织中的表达水平差异不明显。在食管鳞癌组织中PD-1阳性率要显著高于正常食管黏膜，但与食管不典型增生组织无明显差异。PD-1在食管鳞癌组织中的表达与临床病理特征也无明显相关性。Kim等[8]研究认为PD-1的表达和食管鳞癌临床病理特征和预后无明显相关性，这与本研究结果一致，因此我们考虑PD-1在食管癌进展期作用可能更加明显。但Feng等[9]认为PD-1在食管不典型增生组和正常食管组中阳性率差异也较明显，癌变组显著高于正常食管组和食管不典型增生组，这与本研究结果并不一致。PD-L1表达在肿瘤细胞和部分间质细胞的细胞质中，少数腺体细胞的细胞质中也有表达，正常食管组和食管不典型增生组比较阳性率无显著差异。PD-L1在食管鳞癌组织中表达要明显高于正常食管组和食管不典型增生组。本研究证实PD-L1与食管鳞癌浸润层次和TNM分期有显著相关性(P<0.05)这与课题组前期实验结果相似，也与Chen等[10]的研究结果一致。提示PD-L1表达失衡可能是导致食管癌发生的因素之一。

本研究认为PD-L1可能是介导食管鳞癌发生、发展的一个重要因素。因此阻断PD-1/PD-L1通路，恢复T淋巴细胞免疫监视功能，将会是食管鳞癌免疫治疗的新靶点，并会为食管鳞癌治疗提供新的方向。