神香草提取物对哮喘模型大鼠血清代谢物的影响

阿依先木·海比布， 麦合苏木·艾克木， 阿依古·吐热克， 买买提江·阿依丁， 巴图尔·伊明， 阿不都热依木·玉苏甫

(新疆医科大学1维吾尔医学院; 2中心实验室， 乌鲁木齐 830011; 3新疆维吾尔自治区中医民族医药管理局， 乌鲁木齐 830001)

神香草(HyssopusofficinalisL.)是唇形科植物欧神香草的干燥全草，含挥发油、鞣质、树脂、黄酮类和其他的物质[1-2]，具有祛痰、止咳、平喘、解痉、抗衰老、抑菌、抗血小板等药理作用[3-8]。临床上多用于感冒、发热、咳嗽、湿寒性和黏液质性呼吸器官疾病，如寒性哮喘，咳嗽感冒，湿性痰多，胸膜炎，气管炎，肺炎及水肿的治疗[9]。本课题组前期研究表明，神香草总黄酮(SXCF)具有抗炎、平喘、止咳及祛痰作用，并呈剂量依赖性，能够改善哮喘模型大鼠肺功能和肺组织病理改变，降低肺泡灌洗液(BALF)中Ly、Eos、Neu及TGF-β1水平等，减轻哮喘气道炎症[10]。本研究在建立哮喘模型大鼠的基础上干预SXCF，观察大鼠肺组织病理学改变，检测大鼠血清免疫球蛋白E(IgE)水平，观察SXCF对大鼠哮喘模型的影响，并利用核磁共振波谱(1H-NMR)技术探讨SXCF对哮喘模型大鼠血清代谢物的影响，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器C2500-R-230V型高速离心机(美国Labnet公司)，ICV-450型电热恒温培养箱(日本ASONE公司)，MK3型酶标仪(美国Thermo Fisher公司)，W004型压缩式雾化器(江苏富林医疗设备有限公司)，Inova-600型核磁共振波谱仪(美国Varian公司)，GS-15R型低温高速离心机(美国Beckman公司)，DW-86L286型超低温冰箱(青岛海尔特种电器有限公司)，WG-1000-7型核磁管(美国Wilmad-Labglass公司)，BSA224S-CW型电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)，RM2245型病理切片机(德国Leica公司),100-04型图像分析仪(德国Leica公司),DM 3000型显微镜(德国Leica公司)。

1.2试剂SXCF(含量50%以上)由新疆医科大学药学院药分实验室自制。卵清蛋白(OVA，美国Sigma公司，批号A-5253)，20%氢氧化铝胶生理盐水(齐鲁动物保健品有限公司，批号1507006)，醋酸地塞米松(浙江仙琚制药股份有限公司，批号151288)，0.9%氯化钠注射液(国药集团新疆制药有限公司，批号1608008)，4%多聚甲醛固定液(北京索莱宝生物科技有限公司，批号AR10680)，苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(上海莼试生物技术有限公司，批号C0106)，重水(美国CIL公司，批号R03010104)，大鼠免疫球蛋白E(IgE)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，批号E-EL-R0517c)。

1.3药材神香草药材2016年6月购买于新疆维吾尔自治区维吾尔医医院药房，经新疆维吾尔自治区维吾尔医医院制剂中心质检定为神香草(HyssopusofficinalisL.)的干燥地上部分。

1.4动物SPF级雄性SD大鼠60只，体质量(200±30)g，购自新疆医科大学动物实验研究中心[合格证号：SCXY(新)2011-0003]。

2 方法

2.1动物分组、造模及给药将60只大鼠，随机分为6组，分别为正常对照组、哮喘模型组、阳性(地塞米松)对照组及SXCF低、中、高剂量组，每组10只。各组动物均在清洁动物房内室温下相对湿度60%～80%，温度(26±3)℃，用普通饲料饲养，自由饮食水。将大鼠适应性饲养1 w后，于第1、8天，正常对照组生理盐水以1 mL 腹腔注射，其余组均以腹腔注射10%卵清蛋白混合溶液(10 g OVA+氢氧化铝胶生理盐水100 g)1 mL致敏，从实验第15天开始正常对照组(生理盐水0.3 mg/kg体质量)、哮喘模型组(生理盐水0.3 mg/kg体质量)、阳性对照组(醋酸地塞米松0.3 mg/kg体质量)、SXCF低、中、高剂量组(SXCF0.8、0.4、0.2 g/kg体质量)灌胃给药[11]，30 min后分别置于密闭式定制有机玻璃雾化箱内，正常对照组用生理盐水雾化吸入 20 min，其余组均以10% OVA雾化吸入 20 min激发引喘，每天1次，连续16 d。

2.2标本采集由大鼠腹主动脉采血，收集好各组大鼠血液样本在4℃,3 000 r/min离心10 min，分离血清，置于-80℃冰箱保存，用于大鼠血清IgE水平测定。取大鼠右肺中叶，以4%多聚甲醛溶液固定，组织石蜡包埋，按内1/3处进行连续切片(切片厚度约3 μm)，以HE染色试剂盒进行染色，观察肺组织炎症细胞浸润情况。

2.3大鼠血清Ig-E水平检测按照ELISA试剂盒说明书，检测各组大鼠血清IgE水平。

2.41H-NMR大鼠血清样品的处理将大鼠血清室温解冻后，取200 μL，混于400 μL磷酸缓冲液(0.9 g NaCl，882.98 g K2HPO4，141.8 g NaH2PO4配成100 mL，pH值为7.4,以重水溶解)，室温放置10 min后，4℃,10 000 r/min离心10 min，取550 μL上清液转移至5 mm核磁管中，待检。

2.51H-NMR数据采集与预处理采用核磁共振波谱仪对大鼠血清进行1H-NMR检测，频率600 MHz，采扫描次数128次，采样数据点32 k，谱宽10 000 Hz，采样延迟2 s,采样时间1.64 s,测试温度 25℃，用预饱和方式来压制水峰。以乳酸(δ 1.32)质子信号作为化学位移参考峰的位置后调整基线。将1H-NMR谱图在化学位移 δ 0.5～9.0 ppm范围内以δ 0.003 ppm积分区间进行分段积分，剪去4.7～5.2 ppm的水峰。将所出现的所有积分数据用Excel文件格式保存，所得到的数据文件用SIMCA-P+11(瑞典Umetries公司)统计软件进行偏最小二乘判别式法分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA) 进行分析。

3 结果

3.1哮喘模型大鼠的一般状态除正常对照组大鼠外，哮喘模型组大鼠、阳性对照组和SXCF低、中、高剂量组大鼠在雾化激发过程中均出现皮肤瘙痒、挠鼻、腹式呼吸、仰头呼吸、张口呼吸、呼吸频率加速加深、焦躁不安、四肢瘫软及行动迟缓等现象，造模过程中无一只大鼠死亡。

3.2肺组织HE染色观察正常对照组大鼠支气管上皮组织完整，肺泡间隔及腔内无炎症细胞浸润。哮喘模型组大鼠细小支气管壁及伴行血管周围有炎症细胞浸润，以淋巴细胞和嗜酸性粒细胞为主，肺泡腔内炎性细胞渗出，气道黏膜皱褶增多，出现黏膜脱落情况，平滑肌增厚，管腔变窄，部分肺泡壁断裂，融合成肺气肿，肺大泡。与正常对照组比较，阳性对照组和SXCF低、中、高剂量组大鼠上述病理情况有所减轻，见图1。

3.3大鼠血清IgE水平的检测结果与正常对照组比较，哮喘模型组大鼠血清IgE水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与哮喘模型组比较，阳性对照组和SXCF低、中、高剂量组大鼠血清IgE水平下降，差异有统计意义(P<0.05)，见表1。

A: 正常对照组

B: 阳性对照组

C: 哮喘模型组

D: SXCF高剂量组

E: SXCF中剂量组

F: SXCF低剂量组

图1 各组大鼠肺组织HE染色图(×200倍)

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与哮喘模型组比较，#P<0.05；与SXCF高剂量组比较，△P<0.05

3.41H-NMR分析结果

3.4.1 大鼠血清中主要代谢物的1H-NMR归属 通过1H-NMR谱图对6组大鼠血清中的差异性代谢产物成分信号进行了判别分析及归属。差异性的内源性代谢产物有亮氨酸、乳酸、丙氨酸、乙酸、甘氨酸、α葡萄糖、β葡萄糖、肉碱、丙酮、谷氨酸、肌酸、不饱和脂类等代谢产物含量发生变化。这些代谢物存在于氨基酸代谢、糖代谢和脂类代谢，能量代谢等对机体重要的多种生物化学转化的过程，故可将1H-NMR谱图作为哮喘大鼠血清代谢指纹图谱，用来描述大鼠机体病理状况下内源性代谢产物的变化。各组大鼠血清1H-NMR谱图及化合物化归属见图2、表2。

(注：A: 正常对照组；B: 阳性对照组；C: 哮喘模型组；D: SXCF高剂量；E: SXCF中剂量组；F: SXCF低剂量组)

图2各组大鼠血清1H-NMR谱图

3.4.2 模式识别分析结果 将1H-NMR谱图分段积分后得出的积分值以PLS-DA和OPLS-DA法进行分析，得到大鼠血清1H-NMR谱图的3D空间图与平面散点图，见图3。在SIM CA-P+软件中，通过R2X、R2Y和Q2来表示实验过程中所建立模型的质量评价指标。其中R2是所解释的模型差异,Q2是所预测的模型差异。R2、Q2值越接近于1，代表模型拟合度越好，越小代表模型拟合度越差，一般认为模型的预测结果达到“良”的标准必须要Q2>0.4。PLS-DA分析结果显示R2X=0.674， R2Y=0.532，Q2=0.467；Q2>0.4时可以认为模型有一定的可靠性，说明各组大鼠血清代谢成分上有差异性。从标本空间分布情况可以看出各组大鼠血清代谢轮廓区完全分开，各组标本的代谢物存在显著性的差异。从OPLS-DA图来看，正常对照组与哮喘模型组，哮喘模型组与阳性对照组， SXCF高剂量组与哮喘模型组，SXCF中剂量组与哮喘模型组，SXCF低剂量组与哮喘模型组的分布区域是完全分开的，无交叉，无重叠，Q2值依次为0.72、0.923、0.867、0.941、0.918。空间分布图(a)和散点图(b)中横纵坐标是没有单位的标尺，表示2个主成分，每个点代表每一个样本，2组之间无交叉，无重叠，分成2类，说明有差异，见图4～8。

(注：■正常对照组； ●阳性对照组； ◆哮喘模型组； ■SXCF高剂量组； ▲SXCF中剂量组； ★SXCF低剂量组)

图31H-NMR谱图PLS-DA分析3D空间分布图

(注：■正常对照组；●哮喘模型组)

(注：■地塞米松组；●哮喘模型组)

3.4.3 各组大鼠血清代谢物差异性的比较 与正常对照组比较，哮喘模型组大鼠血清代谢物中亮氨酸、丙氨酸、乙酸、谷氨酸、肌酸、甘氨酸、肉碱、α葡萄糖、β葡萄糖化合物含量降低，乳酸、不饱和脂类、丙酮含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与哮喘模型组比较，阳性对照组大鼠血清代谢物中亮氨酸、谷氨酸、乳酸、α葡萄糖、β葡萄糖化合物含量升高，肌酸、丙酮、不饱和脂类含量降低，差异有统计意义(P<0.05)。与哮喘模型组比较，SXCF高剂量组大鼠血清代谢物中亮氨酸、乙酸、谷氨酸、肌酸、甘氨酸、肉碱、β葡萄糖含量升高，乳酸、丙酮、不饱和脂类含量降低，差异有统计意义(P<0.05)； SXCF中剂量组大鼠血清代谢物中亮氨酸、谷氨酸、肉碱、肌酸、β葡萄糖含量升高，乳酸、丙酮含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)； SXCF低剂量组大鼠血清代谢物中亮氨酸、乙酸、谷氨酸、肌酸、丙氨酸、α葡萄糖、甘氨酸、肉碱、β葡萄糖含量升高，乳酸、丙酮、不饱和脂类含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

(注：■哮喘模型组；●SXCF高剂量组)

(注：■哮喘模型组，●SXCF中剂量组)

(注：■哮喘模型组，●SXCF低剂量组)

序号代谢物化学位移相关系数正常组/模型组阳性对照组/模型组模型组/SXCF高剂量组模型组/SXCF中剂量组模型组/SXCF低剂量组1极低密度脂蛋白0.88(m)-0.80-0.76-0.97-0.98-0.981.27(m)1.57(m)2.00(m)2.22(m)2.75(m)2乳酸1.32(d) 0.57 0.80-0.88-0.97-0.674.11(q)3丙氨酸1.47(d)-0.55 0.38 0.663.76(q)4亮氨酸1.72(m)-0.80-0.73 0.92 0.95 0.955乙酸1.91(s)-0.76 0.83 0.866谷氨酸2.14(s)-0.65-0.49 0.55 0.86 0.897丙酮2.23(s) 0.88 0.83-0.96-0.97-0.988肉碱2.45(q)-0.76 0.80 0.86 0.939肌酸3.03(s)-0.76-0.79 0.86 0.86 0.7910b 葡萄糖3.24(dd)-0.56 0.93 0.73 0.85 0.783.40(t)3.49(t)3.90(dd)4.64(d)11a 葡萄糖3.53(dd)-0.54 0.69 0.85 0.673.72(dd)5.23(d)12甘氨酸3.56(s)-0.71 0.87 0.9213不饱和脂类5.30(m) 0.93 0.75-0.86 0.85-0.98

注：S为单峰，d为双重峰，t为三重峰，q为四重峰，m为多峰 ，dd为双重双重峰。

4 讨论

本研究结果表明大鼠哮喘模型建立成功，SXCF可通过抗炎、止咳、平喘作用来降低大鼠血清IgE，改善大鼠肺组织病理改变，减轻气道炎症。从1H-NMR结果来看，哮喘模型组以大鼠血清中的能量代谢，氨基酸，糖代谢等多种代谢途径紊乱为主。SXCF干预后情况有所改善，SXCF可能通过影响并调节大鼠机体内的各种代谢通路出现的紊乱即蛋白质代谢有关的亮氨酸，脂肪代谢有关的不饱和脂肪酸、能量代谢有关的葡萄糖等代谢物而起到减轻大鼠机体的消耗性状态，改善通气和换气功能，改善缺氧状态，增强机体免疫。本研究将为神香草提取物的抗哮喘作用研究提供依据。