TRβ1蛋白在肾透明细胞癌组织和癌旁组织中的表达及临床意义

毕 兴， 陈海霞， 牛 越， 杨 峰， 陈 鹏

(新疆医科大学附属肿瘤医院1泌尿科, 2病理科， 乌鲁木齐 830011)

肾透明细胞癌大约占全身恶性肿瘤的2%，占全部肾脏恶性肿瘤的83%[1]，全球每年有超过10 000人死于该疾病。近年来我国肾透明细胞癌的发病率和死亡率都呈现明显上升趋势[2]。与肾透明细胞癌发生相关的基因研究正在逐步成为研究热点。有研究发现，甲状腺素受体基因突变与肾透明细胞癌的发生发展有关。

甲状腺激素受体(thyroid receptors，TRs)广泛分布于全身所有器官和组织。它除了在机体生长、组织分化和物质代谢中扮演重要角色，现在越来越多的证据表明，它能够抑制细胞恶性转化，表现出抑制肿瘤生长、侵袭和转移的作用[3-4]。缺少甲状腺激素受体，或者是甲状腺激素受体基因的沉默，在人类的癌症或者动物实验模型中是一个常见的现象。关于肾透明细胞癌中TRβ1基因的研究较多，而对于TRβ1蛋白的研究较少。本研究通过免疫组化方法检测肾透明细胞癌和癌旁组织中TRβ1蛋白的表达情况，旨在探讨其在两种组织中的表达差异及其临床意义。

1 对象和方法

1.1研究对象应用随机数字法选取新疆医科大学附属肿瘤医院2011-2017年行手术治疗的肾透明细胞癌患者40例。所有病例均根据2004版WHO肾癌组织学分类标准确诊为肾透明细胞癌，并且术前未行包括放疗、化疗、靶向药物治疗在内的任何抗肿瘤治疗。组织(肾透明细胞癌组织和癌旁组织)标本均经两名病理医师一致判定。患者年龄33～80岁，平均58.8岁；Fuhrman组织学分级:1级9例，2级21例，3级7例，4级3例；分期(根据2010年American Joint Committee on Cancer肾癌分期组合)：Ⅰ期21例，Ⅱ期3例，Ⅲ期13例，Ⅳ期3例。随访9～78个月，术后出现转移13例，未出现转移27例。

1.2实验方法应用免疫组化聚合物法(PV二步法)检测肾透明细胞癌和癌旁组织中TRβ1蛋白的表达情况。选择鼠抗人单克隆抗体TRβ1(J51)：sc-737( Santa Cruz Biotechnology Inc)高压修复，余步骤按常规PV二步法进行。

1.3结果判定标准TRβ1蛋白在肾透明细胞癌(旁)组织中的阳性染色呈颗粒状或团块状，显示为淡黄色、棕黄色和棕褐色。至少观察5～10个高倍镜视野，取其平均值。对阳性细胞进行评分：(1)染色强度：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。(2)阳性细胞所占百分比：阴性为0分，阳性细胞数≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，≥75%为4分。染色强度与阳性细胞所占百分比2项得分相乘，结果<2分为阴性，≥2分为阳性(≥2分且<3分为“+”，≥3分并且<4分为“++”，≥4分为“+++”)

1.4统计学学处理应用SPSS17.0软件对数据进行统计学分析，不同分期、不同组织学分级、是否坏死、是否转移与TRβ1蛋白表达情况的相关分析采用Spearman相关分析；TRβ1蛋白表达与不同病理组织(肾透明细胞癌组织和癌旁组织)表达差异分析采用四格表卡方检验,检验水准均设定为α=0.05。

2 结果

2.1免疫组化染色本组中，肾透明细胞癌组织TRβ1的染色均为阴性(图1)，阳性表达率为0(0/40)；癌旁正常肾组织TRβ1阳性表达率为50%(20/40)，2种组织TRβ1阳性表达率差异有统计学意义(χ2=26.667，P<0.001)。并且TRβ1只在癌旁组织的细胞质中呈现为弱阳性(+)、阳性(++)(图2)，细胞核无阳性表达。

图2 TRβ1蛋白在肾透明细胞癌旁组织中阳性表达(x100)

2.2肾透明细胞癌旁组织TRβ1蛋白表达与临床病理指标的关系TRβ1蛋白在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期肾透明细胞癌旁组织中阳性表达率分别为57.14%(12/21)、66.67%(2/3)、38.46%(5/13)、33.33%(1/3)，TRβ1蛋白在肾透明细胞癌旁组织中的表达与分期无明显相关性(r=-0.215，P=0.183)。TRβ1蛋白在肾透明细胞癌Fuhrman分级1、2、3、4级癌旁组织中阳性表达率分别为66.67%(6/9)、47.62%(10/21)、42.86%(3/7)、33.33%(1/3)，TRβ1蛋白在肾透明细胞癌旁组织中的表达与Fuhrman分级呈负相关性(r=-0.425，P=0.006)。有坏死的肾透明细胞癌癌旁组织中TRβ1蛋白阳性表达率28.57%(2/7)，无坏死的肾透明细胞癌癌旁组织中TRβ1蛋白阳性表达率54.55%(18/33)，肾透明细胞癌癌旁组织中TRβ1蛋白表达与癌组织中是否有坏死无相关性(r=-0.035，P=0.832)。术后发生转移的肾透明细胞癌癌旁组织中TRβ1蛋白阳性表达率46.15%(6/13)，术后没有转移的肾透明细胞癌癌旁组织中TRβ1蛋白阳性表达率51.85%(14/27)，肾透明细胞癌癌旁组织中TRβ1蛋白表达与术后是否发生转移有相关性(r=-0.386，P=0.014),结果见表1。

表1 肾透明细胞癌旁组织TRβ1蛋白表达与临床病理指标的关系/例

3 讨论

随着肾透明细胞癌发病率的不断上升，与其发生、发展相关的分子生物学机制正在受到关注。甲状腺素受体(TRs)属于核受体超家族，三碘甲状腺素(T3)正是通过TRs的介导来发挥生物学作用[5-8]。甲状腺素受体(TRs)是有两条基因TRα和TRβ编码，TRα和TRβ基因分别定位于17q21和3p24。TRα基因编码的受体包括TRα1、TRα2和截短型蛋白△TRα1、△TRα2；TRβ基因编码的受体包括TRβ1、TRβ2 、TRβ3和截短型蛋白△TRβ。以上产物中只有TRα1、TRβ1、TRβ2能和T3特异性的结合，各自的亲和力不同，作用也不同[9-10]。

近年的研究发现TRβ1在多种癌组织中呈现低表达，其基因突变与胃癌、乳腺癌、甲状腺癌、肾透明细胞癌等多种恶性肿瘤的发生相关[11-12]。TRβ1能够抑制肿瘤的发生、侵袭和转移[4]。它可以抑制肿瘤的血管生成，抑制细胞增殖[13]，增加肿瘤细胞的凋亡，阻碍肿瘤细胞对生长因子的反应，降低多种能够促进肿瘤生长的蛋白酶活性和基因表达。其基因突变将造成肿瘤细胞增殖、侵袭和转移。

也有研究表明，TRβ1作用机制与其它信号通路相互交叉。如TRβ1可以和肿瘤抑制因子P53蛋白相结合并加强P53介导的转录活性。相反，P53能够降低TRβ1与DNA结合的能力和激活转录的能力。另外，肾透明细胞癌中miRNAs也反馈调节TRβ1，可能成为致癌因子[14-15]。

本研究的结果显示，应用免疫组化PV二步法在肾透明细胞癌组织中未发现TRβ1蛋白表达，而在与其对照的癌旁正常肾组织中有50%呈现阳性表达，两种不同病理组织差异有统计学意义(P<0.001)。这一结果与Monika等[12]的研究结果基本一致，即TRβ1蛋白在肾透明细胞癌组织中呈明显低表达。因此应用免疫组化PV二步法检测TRβ1蛋白可能有助于肾透明细胞癌的病理鉴别诊断。Monika等[12]的研究还显示，肾透明细胞癌组织中TRβ1在mRNA和蛋白水平表达并不一致，70%的肾透明细胞癌组织中TRβ1 mRNA呈现低表达，而另外30% TRβ1 mRNA呈现高表达。即使在TRβ1 mRNA高表达情况下，应用Western blots 法也仅仅勉强可测出TRβ1蛋白。这与本研究在肾透明细胞癌组织中未发现TRβ1蛋白阳性表达略有不同。笔者认为，造成这种结果的原因主要有两方面：(1)TRβ1蛋白本身浓度不高，且不稳定；(2)方法不同，造成检测的敏感性存在差异。另外，肾透明细胞癌组织中TRβ1蛋白不表达或者低表达这一结果支持TRβ1蛋白抑制肿瘤发生、发展的生物学作用机理。TRβ1蛋白的缺失与肾透明细胞癌的发生、发展密切相关。

本研究发现肾透明细胞癌旁组织中TRβ1蛋白表达情况与病理分期、肿瘤是否有坏死无相关性，与肾透明细胞癌组织Furman分级(r=0.425，P=0.006)呈正相关，与术后是否发生转移呈负相关(r=-0.386，P=0.014)。上述结果提示肾透明细胞癌旁组织中TRβ1蛋白表达情况可能与预后相关。对于上述结果的生物学意义尚不明确，笔者认为肾透明细胞癌旁组织中TRβ1蛋白阳性率(程度)随着肾透明细胞癌组织Furman分级的升高而升高，可能与肿瘤周围组织对于不同恶性程度的肿瘤产生程度不同的TRβ1蛋白应激性升高有关。另一方面，肾透明细胞癌旁组织中TRβ1蛋白阳性率(程度)越高，术后发生转移的几率越低，这也符合TRβ1蛋白的抑癌作用机理。

综上所述，本研究应用免疫组化PV二步法发现肾透明细胞癌组织中TRβ1蛋白无阳性表达，癌旁组织中有50%呈现TRβ1蛋白阳性表达，两组存在明显差异。这一结果提示应用免疫组化PV二步法检测TRβ1蛋白可能有助于肾透明细胞癌的病理鉴别诊断。同时也支持TRβ1蛋白抑制肿瘤发生、发展的生物学作用机理。肾透明细胞癌旁组织中TRβ1蛋白表达情况与肾透明细胞癌组织Furman分级呈正相关，与术后是否发生转移呈负相关。上述结果提示肾透明细胞癌旁组织中TRβ1蛋白表达情况可能与预后相关。而上述结果的生物学意义有待更深层次的研究。另外，由于本研究样本量少，上述实验结果仍需大量研究来证实。