miR-146a在早期乳腺浸润性导管癌组织中的表达及临床意义

付明刚， 迪丽米娜·伊拉木， 郭丽英

(新疆医科大学第一附属医院乳腺外科, 乌鲁木齐 830054)

微小RNA (microRNA,miRNA)是近年来新发现的一类广泛的存在于动物和植物细胞内的非编码单链小分子RNA，其长度约18～25个核苷酸(nucleutide，nt)[1]。目前研究表明，在实体肿瘤细胞中，肿瘤的发生、进展与miRNA表达水平的异常表达关系密切[2-3]，并且直接影响肿瘤的的侵袭性[4-5]。本研究通过原位杂交技术检测60例石蜡包埋的乳腺浸润性导管癌及对应的癌旁组织中miR-146a的表达情况，分析其表达与浸润性乳腺癌相关的临床病理指标之间的关系，从而探讨其是否可作为临床侵袭性及预后的的分子标志物提供依据。

1 材料与方法

1.1临床资料收集新疆医科大学第一附属医院2014年1月-2016年8月手术治疗的乳腺浸润性导管癌患者标本60份，由新疆医科大学临床医学研究院标本库提供，入组患者手术方式为乳腺癌改良根治术，乳腺肿瘤直径≤3 cm，癌旁组织为距癌组织>3 cm的乳腺非肿瘤组织，全部病例均经病理证实，病理资料均完整。入组患者均为女性，年龄30～68岁，中位年龄45岁，排除新辅助化疗患者；患者均接受规范化治疗，手术方式为改良根治术，术后行表阿霉素+多西他赛(TA)方案辅助化疗6个周期，腋窝淋巴结转移数≥4枚行规范化放疗，术后激素受体阳性患者接受内分泌治疗，2017年7月31日为随访截止时间，平均随访时间为23个月。所有标本常规4%福尔马林固定后石蜡包埋，切片厚约4 μm。

1.2主要试剂miR-146a地高辛标记探针为Exiqon公司产品；miRNA ISH Buffer Set (FFPE)购自丹麦Exiqon公司；敏感型原位杂交试剂盒(MK1030)购自武汉博士德生物工程有限公司。DAB显色试剂盒及其它常规试剂购自新疆宝信生物技术有限公司。

1.3实验方法

1.3.1 原位杂交检测miR-146a在乳腺癌组织中的表达 切片用脱蜡液常规脱蜡，3%H2O2室温下浸泡处理切片10 min，采用蒸馏水洗2次；室温下用3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶消化15 min，PBS洗3次，每次5 min；预杂交液37℃预杂交3 h；添加稀释浓度为40 μg/mL的miR-146a 探针，原位杂交盖玻片覆盖后恒温箱37℃杂交过夜(约16 h)；2×SSC洗涤液梯度充分洗涤；封闭液37℃封闭60 min；滴加生物素化鼠抗地高辛室温孵育2 h，PBS漂洗4次，每次5 min；滴加SABC 37℃孵育20 min，PBS洗3次，每次5 min；滴加生物素化过氧化物酶37℃孵育20 min，PBS洗4次，每次5 min；应用二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，充分水洗，PBS返蓝，常规酒精梯度脱水，二甲苯透明，封片。以上各项检测均严格按照试剂盒操作。

1.3.2 原位杂交及免疫组化结果判断 由二位高年资的病理医师采用双盲法对原位杂交结果进行评定。Olympus显微镜下观察评分，miR-146a阳性标准为：其阳性表达于胞浆，呈黄色或棕黄色颗粒状或团块状。采用定性法判断结果：镜下观察5个高倍视野(×200)阳性细胞数 <10%为(-), 阳性细胞数≥10%为(+)。

1.4统计学处理采用SPSS 16.0软件对数据进行处理。采用χ2检验或四格表确切概率法对miR-146a的表达与临床病理特诊进行统计学处理，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1乳腺浸润性导管癌组织中miR-146a表达水平本研究采用原位杂交技术检测60例乳腺癌石蜡组织切片miR-146a的表达，其阳性表达于胞浆中，呈黄色、棕黄色或棕褐色颗粒状或团块状。miR-146a在乳腺癌组织中阳性表达见图1a，在癌旁组织阳性表达见图1b。

a: 癌组织中miR-146a的阳性表达

b: 癌旁组织中miR-146a的阳性表达

图1miR-146a在乳腺浸润性导管癌组织及癌旁组织中的阳性表达

2.2miR-146a在乳腺癌及癌旁组织中的表达情况比较原位杂交结果显示，miR-146a在60例乳腺癌组织中有16例呈阳性表达，阳性表达率为23.3%，miR-146a在60例乳腺癌旁组织中有43例呈阳性表达，阳性表达率为71.7%， miR-146a在乳腺癌组织中的阳性表达率低于癌旁乳腺组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 乳腺癌组织和癌旁组织中miR-146a的表达/例

2.3乳腺浸润性导管癌miR-146a表达与患者临床病理特征之间的关系乳腺浸润性导管癌miR-146a 表达与患者相关临床病理资料之间的关系见表2。原位杂交结果显示，伴淋巴结转移的乳腺癌患者miR-146a阳性表达率明显低于无淋巴结转移者(58.8% vs 14.0%,P=0.001);其表达水平与患者年龄、乳腺肿瘤大小、组织学分级、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及C-erbB-2受体等激素受体状态等无明显关系(P>0.05)。

表2 miR-146a表达与乳腺浸润性导管癌患者临床病理指标间的关系/例(%)

3 讨论

目前的研究表明，miRNA作为一种重要的转录后调控因子，通过降解目标RNA而控制基因的表达，参与了生物体的生长、发育以及肿瘤的发生、发展及复发转移等生理病理过程[6-7]；并通过抑制目标mRNA翻译或诱导目标mRNA降解，在转录后水平调控基因表达[8-9]。相关研究已证实，miRNA成为乳腺癌相关生物治疗靶点[10-12]。miR-146a为miRNA家族中的成员之一，定位于第5号染色体LOC285628基因上，广泛参与了人类多种实体肿瘤的发生、发展及侵袭转移过程[13-15]。

许多医学研究证实，miR-146a在许多肿瘤中下调，推测其与肿瘤的发生、发展密切相关。Liu等[6]研究发现，miR-146a在乳腺癌细胞中明显下调，通过改变其表达可对RhoA蛋白的作用而直接影响MDA-MB-231乳腺癌细胞的迁移和肿瘤细胞侵袭，提示了miR-146a 作为乳腺癌细胞中的肿瘤抑制物。

原位杂交技术通过带有标记物的核酸探针来检测待测组织中核酸的表达及分布情况，是对miRNA表达的定性分析方法之一。本研究通过原位杂交技术发现相对于癌旁组织，浸润性乳腺癌组织中miR-146a的表达明显下调，其表达与患者年龄、乳腺肿瘤的大小、组织学分级及激素受体状态等无明显关系(P<0.05)。本研究在检测浸润性乳腺癌组织中发现， miR-146a表达水平在淋巴结非转移者中明显高于转移者(P<0.05)，提示其表达下调在乳腺癌的侵袭及转移中存在相关性，起到抑制肿瘤侵袭的作用。因此，认为miR-146a 可能成为抑制乳腺癌进展的潜在的预后标志物，但原位杂交技术为一种半定量检测，检测预后指标的潜在价值有限，仍有待一种定量的方法来佐证。

综上所述，在本研究发现相对于乳腺癌癌旁组织，乳腺癌组织中miR-146a的表达水平呈明显下调，通过原位杂交实验发现其表达水平与乳腺癌的淋巴结转移相关，证明其可能为乳腺癌相关的一种抑癌基因，可能参与了乳腺癌的进展。因本实验入选样本较小，且乳腺癌组织中miR-146a表达下调抑制乳腺肿瘤的细胞通路机制不明，其具体机制有待于今后更深入的研究证实。