赤水晒醋中污染杂菌的防治

杨新，卢红梅，白成松，杨华连，陈莉＊

（1.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵阳 550025；2.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵阳 550025）

食醋是一种中国传统的调味品，且深受大众喜爱［1］。食醋是以粮谷为原料经过糖化、酒精发酵、醋酸发酵而制成的含醋酸的液态酸味调味品［2］。随着国家富强、人民生活富裕，人们对食品的需求已经不仅限于营养和感官品质，而且希望在摄入营养的同时能够促进人体健康，达到防病强身、延年益寿的目的［3－5］。按照酿造食醋的工艺分类，主要可以分为固态发酵工艺和液态发酵工艺［6］。采用传统固态发酵法酿制的食醋，不仅色、香、味、体都非常典型，而且还具有浓郁的醇香味，体态澄清［7］。液态发酵酿醋工艺主要是采用纯培养微生物进行发酵，这种工艺产品澄清透明，酸味清爽，产品质量比较稳定，原料利用率高，劳动强度相对较低，生产周期短，可以实现连续性、机械化生产［8］。

20世纪中后期，国内外应用传统微生物分析方法中的纯培养技术研究食醋酿造过程中的功能微生物［9］。目前，传统酿醋行业越来越得到人们的重视，对于食醋的研究从成品醋中风味物质的研究上升到了对食醋酿造机理和食醋中功能微生物的深入研究［10，11］。

赤水晒醋是贵州省赤水市生产的一种具有典型地方特色的优质食醋产品，它的原料选择有讲究，酿造过程精良，对质量标准要求高，而且具有不可复制的独特性。由于传统的赤水晒醋酿造工艺周期长，产量低，难以满足市场需求，因此部分企业对传统工艺进行了改进，以缩短工艺周期，提高产量，但是部分新工艺产品出现了产气、增粘等问题，不仅影响了产品质量安全，也给企业信誉和形象造成了损害。因此，进行食醋中污染杂菌的相关研究成为食醋行业较为迫切的问题。

本研究以不同温度和时间对赤水晒醋中污染杂菌的杀菌效果，多种防腐剂对赤水晒醋中污染杂菌的抑菌效果以及不同温度和不同时间对变质食醋的杀菌效果为研究对象，从而为杂菌的防治提供理论基础及参考，这对于保障赤水晒醋产品质量安全、减少企业经济损失都将具有切实的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

前期从变质赤水晒醋中分离出来的保存于冰箱中的5株菌株，即菌株N3，N5，N7，N9，N11；某晒醋公司提供的样品：出现产气、粘稠现象的晒醋（以下简称问题食醋）；苯甲酸钠（食品级）、山梨酸钾（食品级）：上海博微生物科技有限公司；尼泊金乙酯（食品级）：天津市永大化学试剂有限公司；丙酸钙（食品级）：成都临江化工厂；尼泊金丙酯（食品级）：重庆北碚精细化工厂；LB液体培养基：按相关文献进行配制。

1.2 仪器与设备

BCD－290W冰箱 青岛海尔股份有限公司；HYG－A全温摇瓶柜 金坛市盛蓝仪器制造有限公司；SPX－250B智能型生化培养箱、pHS－3CpH 计、SN－CJ－IF洁净工作台 上海琅玕实验设备有限公司；722S可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；DHG－9140B（101－2B）智能电热恒温鼓风干燥箱、YXQ－LS－5DS11立式压力蒸汽杀菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；ESJ220－4B电子天平 沈阳龙腾电子有限公司；CH2043微电脑电磁炉 中山市格兰仕生活电器制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 杀菌温度和时间对污染杂菌的影响

活化菌种：将前期从变质赤水晒醋中分离的保存于冰箱中的菌株接种在装有100mL LB液体培养基（最适pH，最适盐度）的三角瓶中，在筛选温度下培养至菌液浓度达到106～107cfu/mL。

接种活化的菌种按10%的接种量接种到LB液体培养基（最适pH，最适盐度），静置培养24h。培养结束后，按表1的处理方式进行杀菌处理，每个处理3个平行，以杀菌处理前后作为对照，杀菌处理完成之后，吸取合适稀释度的0.20mL稀释液涂布于营养琼脂平板上，然后培养2～3天，最后采用菌落计数法计算得出菌落总数［12］。

表1 杀菌温度、时间对微生物生长的影响Table 1The effect of sterilization temperature and time on the growth of microorganisms

续 表

菌落总数计算公式：

式中：KZ为总菌落数，cfu/mL；k为稀释倍数；x为同一稀释度3个平皿上的菌落平均值；V为取样体积。

杀菌率计算公式：

式中：R1为抑菌率；K0为杀菌处理前菌落数；K1为杀菌处理后菌落数。

1.3.2 不同防腐剂对菌株生长的影响

该实验选用苯甲酸钠、山梨酸钾、尼泊金乙酯、丙酸钙、尼泊金丙酯5种防腐剂来研究防腐剂对5种微生物生长的影响［13］。根据 GB 2760－2014《食品添加剂使用标准》在食醋中的规定：苯甲酸钠和山梨酸钾在食醋中的最大使用量均是1.00g/kg，尼泊金乙酯在食醋中的最大使用量是0.25g/kg，尼泊金丙酯在食醋中的最大使用量是0.10g/kg，丙酸钙在食醋中的最大使用量是2.50g/kg，实验均在规定的最大添加量内进行［14－16］。实验中的防腐剂浓度水平见表2。

表2 防腐剂浓度水平Table 2The levels of preservatives concentration g/L

本实验仅做防腐剂的单因素实验，按表2的浓度水平添加到实验用培养基中。

在无菌条件下，用无菌蒸馏水分别配制苯甲酸钠、山梨酸钾、尼泊金乙酯、丙酸钙、尼泊金丙酯母液，母液浓度分别为50.00，50.00，12.50，125.00，5.00g/L，再按表3的添加量，用移液枪分别添加到装有5mL已分别接有菌种的LB液体培养基的试管中，每支试管做3个平行，放置在45℃下摇床培养24h。同时，以加等量生理盐水作为对照。

表3 防腐剂添加量Table 3The additive amount of preservatives

结果测定：培养结束后，采用平板计数法对这5株菌进行3次平行重复测定，取其平均值，吸取合适稀释度的0.20mL稀释液涂布于平板上，通过菌落计算公式计算得出菌落总数，同时根据抑菌率公式计算其抑菌率。抑菌率越大，防腐剂的防腐效果就越好。

抑菌率计算公式：

式中：R2为抑菌率；K2为添加生理盐水对照组的菌落数；K3为添加防腐剂的菌落数。

1.3.3 杀菌温度和时间对变质赤水晒醋中微生物的影响

取10.00mL问题食醋加到100mL锥形瓶中，按表4的处理方式进行杀菌处理，每个处理3个平行；以不处理的作为对照。杀菌处理完后，对其杀菌醋液做感官评价，并吸取合适稀释度的醋液0.20mL涂布于营养琼脂平板上，培养2～3天。培养结束后，进行菌落计数并计算杀菌率。

表4 杀菌温度、时间对食醋的影响Table 4The effect of sterilization temperature and time on vinegar

2 结果与分析

2.1 杀菌温度和时间对赤水晒醋中污染杂菌的影响

2.1.1 杀菌温度和时间对菌株N3的影响

在实验条件下，对菌株 N3分别进行10，20，30min杀菌处理，以杀菌温度为横坐标、杀菌率为纵坐标，绘制菌株N3在杀菌过程中杀菌率的变化曲线，结果见图1。

图1 杀菌时间和温度对菌株N3的影响Fig.1The effect of sterilization time and temperature on strain N3

由图1可知，在杀菌过程中杀菌率随杀菌温度的增加而增加，杀菌温度和杀菌时间对菌株N3的影响较大。在杀菌温度为75～115℃，杀菌10min时，杀菌率在30.98%～54.98%之间，杀菌率较低；杀菌20min时，杀菌率在44.95%～93.12%之间，杀菌率较高；杀菌30min时，杀菌率在44.95%～97.25%之间，杀菌率较高。在不同杀菌时间下，杀菌20min比杀菌10min的杀菌率有明显的提高，杀菌30min比杀菌20min的杀菌率有所提高。杀菌温度越高，杀菌时间越长，杀菌效果越好。

2.1.2 杀菌温度和时间对菌株N5的影响

在实验条件下，对菌株 N5分别进行10，20，30min杀菌处理，以杀菌温度为横坐标、杀菌率为纵坐标，绘制菌株N5在杀菌过程中杀菌率的变化曲线，结果见图2。

图2 杀菌时间和温度对菌株N5的影响Fig.2The effect of sterilization time and temperature on strain N5

由图2可知，在杀菌过程中杀菌率随杀菌温度的增加而增加，杀菌温度和杀菌时间对菌株N5的影响较大。在杀菌温度为75～115℃，杀菌10min时，杀菌率在49.85%～79.95%之间，杀菌率较低；杀菌20min时，杀菌率在60.05%～99.75%之间，杀菌率较高；杀菌30min时，杀菌率在65.08%～99.75%之间，杀菌率较高。杀菌20min比杀菌10min的杀菌率有明显的提高，杀菌30min与杀菌20min的杀菌率相当。杀菌温度越高，杀菌时间越长，杀菌率越高。

2.1.3 杀菌温度和时间对菌株N7的影响

在实验条件下，对菌株 N7分别进行10，20，30min杀菌处理，以杀菌温度为横坐标、杀菌率为纵坐标，绘制菌株N7在杀菌过程中杀菌率的变化曲线，结果见图3。

图3 杀菌时间和温度对菌株N7的影响Fig.3The effect of sterilization time and temperature on strain N7

由图3可知，在杀菌过程中杀菌率随杀菌温度的增加而增加，杀菌温度和杀菌时间对菌株N7的影响较大。在杀菌温度为75～115℃，杀菌10min时，杀菌率在30.95%～54.95%之间，杀菌率较低；杀菌20min时，杀菌率在44.90%～93.05%之间，杀菌率较高；杀菌30min时，杀菌率在44.95%～97.25%之间，杀菌率较高。杀菌20min比杀菌10min的杀菌率有明显的提高，杀菌30min比杀菌20min的杀菌率有一定的提高，但没有前面明显。杀菌温度越高，杀菌时间越长，杀菌率越高。

2.1.4 杀菌温度和时间对菌株N9的影响

在实验条件下，对菌株 N9分别进行10，20，30min杀菌处理，以杀菌温度为横坐标、杀菌率为纵坐标，绘制菌株N9在杀菌过程中杀菌率的变化曲线，结果见图4。

图4 杀菌时间和温度对菌株N9的影响Fig.4The effect of sterilization time and temperature on strain N9

由图4可知，在杀菌过程中杀菌率随杀菌温度的增加而增加，杀菌温度和杀菌时间对菌株N9的影响较大。在杀菌温度为75～115℃，杀菌10min时，杀菌率在25.02%～40.25%之间，杀菌率较低；杀菌20min时，杀菌率在44.05%～93.85%之间，杀菌率较高；杀菌30min时，杀菌率在54.05%～93.85%之间，杀菌率较高。杀菌20min比杀菌10min的杀菌率有明显的提高，杀菌30min比杀菌20min的杀菌率有一定的提高，但没有前面明显。杀菌温度越高，杀菌时间越长，杀菌率越高。

2.1.5 杀菌温度和时间对菌株N11的影响

在实验条件下，对菌株N11分别进行10，20，30min杀菌处理，以杀菌温度为横坐标、杀菌率为纵坐标，绘制菌株N11在杀菌过程中杀菌率的变化曲线，结果见图5。

图5 杀菌时间和温度对菌株N11的影响Fig.5The effect of sterilization time and temperature on strain N11

由图5可知，在杀菌过程中杀菌率随杀菌温度的增加而增加，杀菌温度和杀菌时间对菌株N11的影响较大。在杀菌温度为75～115℃，杀菌10min时，杀菌率在34.54%～57.05%之间，杀菌率较低；杀菌20min时，杀菌率在45.82%～96.12%之间，杀菌率较高；杀菌30min时，杀菌率在49.97%～96.12%之间，杀菌率较高。杀菌20min比杀菌10min的杀菌率有明显的提高，杀菌30min比杀菌20min的杀菌率有一定的提高，但没有前面明显。杀菌温度越高，杀菌时间越长，杀菌率越高。

2.2 防腐剂对污染杂菌的影响

在实验条件下，通过菌落计算公式计算得到不同条件下的菌落总数，然后用杀菌率公式计算得到不同条件下的杀菌率，从而绘制直方图。

2.2.1 各种防腐剂对菌株N3的影响

图6 不同浓度水平的各种防腐剂对菌株N3的抑菌率Fig.6The inhibition rate of different content levels of various preservatives on strain N3

由图6可知，5种防腐剂（苯甲酸钠、山梨酸钾、尼泊金乙酯、丙酸钙和尼泊金丙酯）对菌株N3的抑菌率均在96.90%以上，当5种防腐剂均按国标GB/T 2760－2011规定的最大量添加时，丙酸钙的抑菌率＞山梨酸钾的抑菌率＞尼泊金丙酯的抑菌率＞尼泊金乙酯的抑菌率＞苯甲酸钠的抑菌率。山梨酸钾和尼泊金乙酯的浓度变化对菌株N3的抑菌率有较大的影响，山梨酸钾的浓度从1.00g/L调为0.20g/L时，对菌株N3的抑菌率从98.98%下降到97.53%，下降了1.45%；尼泊金乙酯的浓度从0.25g/L调为0.05g/L时，对菌株N3的抑菌率从98.66%下降到96.90%，下降了1.76%。苯甲酸钠、丙酸钙和尼泊金丙酯的浓度变化对菌株N3的抑菌率影响不大，抑菌率变化均不大于0.61%。

2.2.2 各种防腐剂对菌株N5的影响

图7 不同浓度水平的各种防腐剂对菌株N5的抑菌率Fig.7The inhibition rate of different content levels of various preservatives on strain N5

由图7可知，5种防腐剂（苯甲酸钠、山梨酸钾、尼泊金乙酯、丙酸钙和尼泊金丙酯）对菌株N5的抑菌率均在96.60%以上，当5种防腐剂均按国标GB/T 2760－2011规定的最大量添加时，苯甲酸钠的抑菌率＞丙酸钙的抑菌率＞尼泊金丙酯的抑菌率＞山梨酸钾的抑菌率＞尼泊金乙酯的抑菌率。山梨酸钾和尼泊金乙酯的浓度变化对菌株N5的抑菌率有较大的影响，山梨酸钾的浓度从1.00g/L调为0.20g/L时，对菌株N5的抑菌率从98.48%下降到97.03%，下降了1.45%；尼泊金乙酯的浓度从0.25g/L调为0.05g/L时，对菌株N5的抑菌率从98.36%下降到96.60%，下降了1.76%。苯甲酸钠、丙酸钙和尼泊金丙酯的浓度变化对菌株N5的抑菌率影响不大，抑菌率变化均不大于0.68%。

2.2.3 防腐剂对菌株N7的影响

图8 各防腐剂不同浓度水平对菌株N7的抑菌率Fig.8The inhibition rate of different content levels of various preservatives on strain N7

由图8可知，5种防腐剂（苯甲酸钠、山梨酸钾、尼泊金乙酯、丙酸钙和尼泊金丙酯）中，除了丙酸钙的抑菌率在88.66%～91.23%之间外，其他4种防腐剂对菌株N7的抑菌率均在96.30%以上，当5种防腐剂均按国标GB/T 2760－2011规定的最大量添加时，山梨酸钾的抑菌率＞尼泊金乙酯的抑菌率＞苯甲酸钠的抑菌率＞尼泊金丙酯的抑菌率＞丙酸钙的抑菌率。丙酸钙和尼泊金乙酯的浓度变化对菌株N7的抑菌率有较大的影响，丙酸钙的浓度从2.50g/L调为0.50g/L时，对菌株N7的抑菌率从91.23%下降到88.66%，下降了2.57%；尼泊金乙酯的浓度从0.25g/L调为0.05g/L时，对菌株N7的抑菌率从98.44%下降到96.30%，下降了1.14%。苯甲酸钠、山梨酸钾和尼泊金丙酯的浓度变化对菌株N7的抑菌率影响不大，抑菌率变化均不大于0.88%。

2.2.4 防腐剂对菌株N9的影响

图9 各防腐剂不同浓度水平对菌株N9的抑菌率Fig.9The inhibition rate of different content levels of various preservatives on strain N9

由图9可知，5种防腐剂（苯甲酸钠、山梨酸钾、尼泊金乙酯、丙酸钙和尼泊金丙酯）对菌株N9的抑菌率均在97.02%以上，当5种防腐剂均按国标GB/T 2760－2011规定的最大量添加时，苯甲酸钠的抑菌率＞丙酸钙的抑菌率＞山梨酸钾的抑菌率＞尼泊金丙酯的抑菌率＞尼泊金乙酯的抑菌率。山梨酸钾和尼泊金乙酯的浓度变化对菌株N9的抑菌率有较大的影响，山梨酸钾的浓度从1.00g/L调为0.20g/L时，对菌株 N9的抑菌率从98.98%下降到97.56%，下降了1.42%；尼泊金乙酯的浓度从0.25g/L调为0.05g/L时，对菌株 N9的抑菌率从98.71%下降到97.02%，下降了1.69%。苯甲酸钠、丙酸钙和尼泊金丙酯的浓度变化对菌株N9的抑菌率影响不大，抑菌率变化均不大于0.65%。

2.2.5 防腐剂对菌株N11的影响

图10 各防腐剂不同浓度水平对菌株N11的抑菌率Fig.10The inhibition rate of different content levels of various preservatives on strain N11

由图10可知，5种防腐剂（苯甲酸钠、山梨酸钾、尼泊金乙酯、丙酸钙和尼泊金丙酯）中，只有苯甲酸钠和丙酸钙对菌株N11的抑菌率在97.85%以上，山梨酸钾、尼泊金乙酯和尼泊金丙酯对菌株N11的抑菌率均在92.00%～94.71%。当5种防腐剂均按国标GB/T 2760－2011规定的最大量添加时，苯甲酸钠的抑菌率＞丙酸钙的抑菌率＞山梨酸钾的抑菌率＞尼泊金乙酯的抑菌率＞尼泊金丙酯的抑菌率。山梨酸钾和丙酸钙的浓度变化对菌株N11的抑菌率有较大的影响，山梨酸钾的浓度从1.00g/L调为0.20g/L时，对菌株N11的抑菌率从94.71%下降到93.64%，下降了1.07%；丙酸钙的浓度从2.50g/L调为0.50g/L时，对菌株N11的抑菌率从98.71%下降到97.02%，下降了1.69%。苯甲酸钠、尼泊金乙酯和尼泊金丙酯的浓度变化对菌株N11的抑菌率影响不大，抑菌率变化均不大于0.86%。

2.3 杀菌温度和时间对变质赤水晒醋中微生物的影响

在实验条件下，通过实验及计算得到不同处理方式下的菌落数和抑菌率，并通过感官评价得到食醋的感官评语，结果见表5。

表5 杀菌温度和时间对变质赤水晒醋中微生物的影响Table 5The effect of sterilization temperature and time on microorganisms in the metamorphic Chishui sun vinegar

由表5可知，随着杀菌温度的升高和杀菌时间的延长，杀菌率逐渐提高。采用单次杀菌（即：一次杀菌结束后就用来检测微生物含量），杀菌率≤96.57%；采用两次杀菌（即：一次杀菌结束后，隔夜，再进行第二次杀菌），杀菌率有了显著的提高，杀菌率达到98.13%以上。显然两次杀菌的效果比单次杀菌的效果要好，在85℃杀菌30min，杀菌率提高了28.97%；在95℃杀菌30min，杀菌率提高了1.56%。可能的原因是，问题食醋中的微生物主要是芽孢杆菌，第一次杀菌时，消灭了问题食醋中的非芽孢状态的微生物，问题食醋中的芽孢没有被消灭。待隔夜之后，问题食醋的芽孢萌发，成为活跃的微生物。进行第二次杀菌时，由芽孢萌发的微生物被消灭。因此，经过两次杀菌，使得杀菌率得到很大的提高。虽然延长杀菌时间和进行两次杀菌能够很大地提高杀菌率，但是，杀菌的时间和进行两次杀菌对食醋的风味影响很大。所以，在采取对食醋进行杀菌的方式上应该慎重考虑。

3 结论

赤水晒醋受杂菌污染后，通过实验得出杀菌温度和时间对5株污染杂菌的影响不一样，但杀菌率都随温度和时间的增加而增加，温度越高、时间越长，杀菌效果越好，对食醋中微生物的杀菌效果也越好，两次杀菌比单次杀菌效果好，但是，杀菌温度过高（超过95℃）、时间过长和两次杀菌，会导致食醋的风味发生改变，如食醋变得焦糊香或糊味、酸味很低等。综合考虑杀菌温度、杀菌时间、杀菌次数以及杀菌后食醋的风味变化得出：95℃杀菌30min是比较好的方案，杀菌率达到了96.57%。

不同防腐剂对这5株菌的影响均不一样。5种防腐剂（苯甲酸钠、山梨酸钾、尼泊金乙酯、丙酸钙和尼泊金丙酯）对菌株N3，N5和N9的抑菌率均在96.30%以上，而对菌株N7，N11的抑菌率均在88.66%以上，其中，苯甲酸钠、山梨酸钾、尼泊金乙酯和尼泊金丙酯对菌株N7的抑菌率均在96.30%以上，苯甲酸钠和丙酸钙对菌株N11的抑菌率均在97.85%以上。综合考虑5种防腐剂对5株菌的影响，苯甲酸钠对这5株菌的抑菌率是最高的，这对赤水晒醋的产气及增粘方面的防治具有借鉴意义。