碱法预处理麦糟酶解转化还原糖工艺研究

连战，吕志飞，刘彬，刘欣，庄倩倩，刘同军

（齐鲁工业大学（山东省科学院）生物工程学院，济南 250353）

麦糟是啤酒生产中数量最多的副产物，大约占到了所有副产物的85%左右。而我国作为啤酒生产大国，每年麦糟的产量高达500万吨［1，2］。传统的对于麦糟的处理方式诸如堆肥，作为粗饲料等方式利用率较低，且极易造成环境污染，一种合理利用麦糟的方式亟待研究［3－5］。

相关研究表明，麦糟富含纤维素与半纤维素，可通过预处理及酶解转化为葡萄糖与木糖等还原糖，经分离纯化后用于食品工业的生产，木糖可通过还原加氢生产木糖醇，且经过酶解法产生的麦糟酶解液，木糖与葡萄糖纯度较高，副产物较少，还原糖分离纯化难度相应得到降低［6－8］。与其他生物质资源相比，经过啤酒生产过程的麦糟，木质素含量下降，结构发生变化，对打破利用纤维素与半纤维素的生物质壁障有一定的效果，但仍然存在一定难度。有效的预处理方法、合适的酶解工艺都需要进一步的研究［9］。碱过氧化氢法能有效破坏木质纤维素结晶区，使孔隙率和内表面积增大，同时去除木质素，从而有效破除酶解产生可发酵糖的生物质壁障［10－12］。本文通过对低浓度与高浓度麦糟直接进行酶解，探究AHP预处理对麦糟酶解效率的影响，同时因经过啤酒酿造过程，麦糟成分与结构发生变化，AHP预处理的加碱量也需要重新进行优化。在碱过氧化氢法预处理的技术上进一步对麦糟进行水洗，去除酶活抑制物，以提高酶解转化率，并在水洗的基础上通过Mixture设计对多酶联合酶解麦糟的加酶比例进行优化，为高效利用麦糟转化还原糖提供一条有效的途径。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料

麦糟：由齐鲁工业大学（山东省科学院）工程训练中心中德啤酒技术中心提供。

1.1.2 试剂

硫酸、5mol/L NaOH、H2O2：实验试剂均为分析纯。

1.1.3 酶

纤维素酶（ctec2）、半纤维素酶（htec2）与果胶酶：均来自丹麦诺维信公司。

1.2 实验方法

1.2.1 成分分析

纤维素、半纤维素、木质素、还原糖及其他主要成分测定参照美国国家可再生能源实验室（NREL）Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass测定方法进行。

1.2.2 未预处理麦糟直接酶解

实验选择10%，15%，20%的底物浓度进行酶解。准确称取3.0g麦糟于50mL三角瓶中，按照实验设计底物浓度加蒸馏水并混匀，使用72%H2SO4调节pH至5.2，分别添加ctec2与htec2，添加量为50mg总蛋白/g纤维素，添加比例为0.77∶0.23［13］，混匀后置于50℃恒温振荡培养箱中170r/min振摇24h，酶解结束后沸水浴灭活3～5min，取样1mL于1.5mL离心管中，12000r/min下离心3～5min，取上清液测定葡萄糖及木糖浓度。

1.2.3 碱过氧化氢法预处理加碱量的优化

实验设计 NaOH 添加量为0.06，0.08，0.10g（NaOH/g麦糟），准确称取3.0g麦糟置于50mL三角瓶中，按照实验设计量称取NaOH于小烧杯中，加适量蒸馏水溶解，称取H2O2溶液（H2O2/麦糟添加比例为0.1g/g），将混合均匀的NaOH溶液加入盛有小麦秸秆样品三角瓶中，混匀后加入 H2O2溶液，置于30℃恒温振荡器中振摇，每隔2h测定并记录pH。预处理结束，用72%H2SO4调节pH 至5.2，按照1.2.2步骤酶解并取样测定糖浓度。

1.2.4 不同底物浓度下麦糟酶解

在上述实验条件下分别考察酶解底物浓度10%，15%，20%（W/V）下酶解效率的变化。预处理结束后，向预处理麦糟中添加72%H2SO4调节pH至5.2，按照1.2.2酶解步骤进行酶解并取样测定糖浓度。

1.2.5 酶解时间对糖得率的影响

实验设计底物浓度为25%，称取9.0g麦糟于300mL三角瓶中，在上述实验条件下进行预处理及酶解，并在酶解12，24，36，48，72h分别取样测定糖浓度。

1.2.6 水洗对麦糟酶解糖得率的影响

准确称取15.0g麦糟于300mL三角瓶中，按照

1.2.3进行预处理，实验设计底物浓度为25%。预处理完毕后置于16层细密纱布上，1.5L蒸馏水多次冲洗至滴下液体无色。挤压去除水分，准确称取0.50g挤压后的底物，恒温干燥箱105℃烘干4h后称重并计算含水量，补水至原有底物浓度（25%），调节pH至5.2，按照1.2.2步骤进行酶解，取样测定糖浓度并计算转化率。

1.2.7 基于响应面法三酶联合酶解水洗麦糟的Mixture实验设计

以水洗后AHP预处理的麦糟为底物，酶解葡萄糖转化率为考察指标，使用 Design－Expert 8.0（DX8）软件进行Mixture实验设计，优化纤维素酶（ctec2）、半纤维素酶（htec2）与果胶酶的添加比例。预处理及酶解按照1.2.3与1.2.4步骤进行。按照方案进行实验并通过软件进行分析，并对最佳加酶方案进行验证实验。

1.2.8 测定与计算

葡萄糖及木糖的糖浓度通过高效液相色谱进行测定，色谱柱为美国伯乐Aminex－87H色谱柱。检测器为示差－折光检测器，流动相为0.005mol/L H2SO4，柱温为65℃，流速为0.6mL/min。通过建立标准曲线对糖浓度进行计算。

纤维素→葡萄糖、半纤维素→木糖酶解转化率分别按公式（1）与公式（2）计算。

式中：0.9为纤维素到葡萄糖的转化系数；0.88为半纤维素到木糖的转化系数。

2 结果与讨论

2.1 成分分析

采用NREL法进行成分分析，结果见图1。传统的生物质炼制原料多使用玉米、小麦等作物秸秆，与玉米秸秆30%～36%的纤维素含量，20%～26%的半纤维素含量、小麦秸秆31%～35%的纤维素含量，21%～25%的半纤维素含量相比［14－17］，麦糟纤维素及半纤维素含量相对较低，但经过啤酒生产发酵的过程，木质素含量明显下降，酶解的生物质壁障在一定程度上被破坏，意味着预处理难度的降低，选择合理的预处理及酶解方式，会获得相对理想的糖得率。

图1 麦糟成分组成

2.2 碱过氧化氢法预处理加碱量的优化

对碱过氧化氢法加碱量优化pH监测结果见图2。不同加碱量下pH变化趋势大致保持一致：在向麦糟中加入预处理液并搅拌均匀后，0.06，0.08，0.10g加碱量起始pH 分别为11.45，11.65，11.78，在1h后pH迅速上升，在4h左右达到峰值（0.06g加碱量下为1h），4h后pH逐步下降，pH的下降与预处理过程中NaOH与H2O2联合作用被逐步消耗有关。三者在24h预处理后pH分别下降至11.18，11.94，12.38。

图2 不同加碱量预处理pH变化

在不同加碱量下的酶解糖转化率见图3。在0.06g/g NaOH 添 加 量 下 转 化 率 明 显 低 于0.08，0.10g/g NaOH添加量，三者的葡萄糖转化率分别为89.55%，93.17%，93.36%，NaOH 添加量从0.06g/g 增加到0.08g/g时，葡萄糖转化率提升了3.62%，而继续增加NaOH添加量至0.10g/g，葡萄糖转化率仅提升0.19%，增幅很小。相关研究表明，在碱过氧化氢预处理中，增加碱及过氧化氢添加量能有效提高酶解转化率，在pH 11.5附近进行预处理能获得较高的糖得率，但也有研究表明最适pH水平要高于11.7，同时不同的pH下过氧化氢的量也有所不同，这与木质纤维素原料的特性以及反应的底物浓度有关［18］，0.08g/g添加量下整体pH水平与这类研究接近。实验结果表明0.08g/g的碱添加量能获得较高的糖转化率，再增加NaOH添加量，对于转化率提升效果较小，且会增加预处理成本。

图3 不同加碱量预处理对酶解糖转化率的影响

2.3 AHP预处理对麦糟酶解效果的影响

未经预处理直接进行酶解的麦糟糖得率见图4。在10%底物浓度下，葡萄糖及木糖转化率分别达到了54.4%，56.68%。随着底物浓度的增加，糖浓度逐步升高，而转化率迅速下降，到20%底物浓度，葡萄糖及木糖转化率降低至44.7%，47.4%，而经碱过氧化氢预处理的同底物浓度组转化率则达到了74.5%，60.7%，分别提高29.8%，13.3%，转化率大幅提高。李夏兰等采用较低浓度酸碱预处理麦糟，在1∶40固液比（W/V）下获得酶解糖转化率为78.5%，且其反应体系底物浓度较低［19］，明显低于本实验中10%底物浓度（相当于固液比1∶10）84.1%的纤维素酶解转化率。实验结果表明碱过氧化氢法能有效提高麦糟酶解转化率，获得的酶解液糖得率明显提高。

图4 AHP预处理对不同底物浓度酶解效率的影响

2.4 酶解时间对麦糟糖得率的影响

酶解时间对糖转化率的影响见图5。在0～12h，纤维素与半纤维素不断转化成葡萄糖以及木糖，随着液化的进行，转化率迅速提高。12～24h，葡萄糖及木糖转化率分别达到了69.4%，57.5%，之后迅速进入平台期。随着糖及抑制物浓度的升高，转化率增速明显放缓，并在24～48h开始趋于稳定。48～72h，转化率变化较小，72h后转化率水平基本稳定。在24h，葡萄糖与木糖转化率达到稳定的水平，葡萄糖与木糖浓度分别超过40，25g/L，还原糖产率及酶解效率较好，以24h作为酶解反应周期较理想。

图5 酶解时间对糖转化率的影响

2.5 水洗对麦糟酶解糖得率的影响

对25%底物浓度下AHP预处理麦糟进行水洗后酶解转化率见表1。

表1 水洗对高底物浓度麦糟转化率的影响%

经过水洗，葡萄糖与木糖转化率均有明显提升，分别提升了6.43%，3.87%。转化率的提升与水洗去除了部分酶活抑制物（阿魏酸、对香豆酸等）以及水洗后明显降低的液体粘度、明显提高的传质效率有关。水洗在对抑制物去除的同时也带来了固形物的损失，挤压带来的木质纤维素角质化等不良影响，减少了固形物损失，则转化率将大幅提升。

2.6 纤维素酶、半纤维素酶与果胶酶复合酶解Mixture设计

以酶解葡萄糖转化率为考察指标，利用Design－Expert 8.0（DX8）软件进行 Mixture实验设计，设计纤维素酶、半纤维素酶与果胶酶添加方案，其实验方案与结果见表2。

表2 Mixture设计实验结果

2.7 回归模型的建立

运用Design－Expert 8.0（DX8）软件对数据进行分析，并进行拟合得到的方程式为：Y（%）＝0.78A＋0.63B＋0.018C＋0.69AB＋1.65AC＋0.68BC＋0.10AB（A－B）－2.43AC（A－C）－0.96BC（B－C），该模型的相关系数R2为0.9100，表明91.00%的实验数据能符合这一模型的拟合。

表3 回归模型显著性检验

由表3可知，模型的F值为10.12，P值为0.0018，P≤0.01，说明该模型处于极显著水平。同时，Adeq Precision信噪比为10.347，信噪比大于4是理想的［20］，表明该模型信号很强。综上所述，该模型能很好地解释响应值的变化，得到的回归方程模拟三因素三水平的设计分析是可行的。

2.8 影响酶解转化率的响应面分析

以酶解葡萄糖转化率为响应指标值，对纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶3个因素进行响应面分析，对应的响应面图谱和等高线图见图6和图7。

图6 纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶之间的交互作用的立体分析图

图7 纤维素酶、半纤维素酶与果胶酶之间的交互作用的等高线图

由图6和图7可知3个因素之间的交互作用对酶解转化率的影响。等高线呈现的圆形与椭圆形表示不同因素之间的交互作用的强弱［21，22］。由图6和图7可知，纤维素酶和半纤维素酶以及半纤维素酶和果胶酶之间存在一定交互作用，纤维素酶和果胶酶之间的交互作用极为显著。

2.9 验证实验

利用 Design Expert 8.5Mixture设计给出的最优加酶方案为ctec2∶htec2为0.63∶0.37，按照推荐的加酶比例，在上述预处理条件下进行酶解验证实验，并设置原加酶比例（0.77∶0.23）为对照组，3次平行实验得到的纤维素到葡萄糖的转化率为89.73%，与理论预测值88.96%相比高 0.77%，相对误差为0.87%＜10%，且明显高于对照组82.64%的葡萄糖转化率，且半纤维素到木糖的转化率也有明显提升，相对提升7.5%。结果表明采用Mixture设计优化的加酶方案准确可行。

3 结论

利用碱过氧化氢法对麦糟进行预处理能有效提高不同底物浓度下麦糟纤维素到葡萄糖以及半纤维素到木糖的转化率。酶解时间24h，在较低底物浓度下（10%）酶解葡萄糖的转化率可达到80%以上，高底物浓度下（25%）转化率可达70%。在碱过氧化氢预处理基础上进一步对麦糟进行水洗，能有效提高糖酶解转化率。

本实验确定了碱法预处理麦糟酶解转化还原糖的工艺：预处理NaOH添加量0.08g/g底物，底物浓度25%，预处理后水洗，酶解时间24h，加酶比例ctec2∶htec2为0.63∶0.37。在该工艺条件下，纤维素到葡萄糖的转化率与半纤维素到木糖的转化率可分别达到89.73%，65.75%，较未预处理及优化前分别提升约45%，18%。在该工艺下对麦糟进行碱过氧化氢法预处理、水洗、酶解，能实现葡萄糖与木糖的高效转化，这为啤酒工业合理利用麦糟提供了一条有效的途径，也为利用生物质资源绿色生产葡萄糖与木糖等还原糖提供了一种合理的方式。