发酵法提纯草石蚕中水苏糖的工艺研究

周文斯，熊犍，谢瑾，崔春，王炜

（华南理工大学 食品科学与工程学院，广州 510640）

水苏糖（Stachyose）是棉籽糖家族的一员。由半乳糖－半乳糖－葡萄糖－果糖构成的四糖，是一种非还原糖，广泛分布于植物界，在植物的各个部分存在，与蔗糖同为糖类的运转和储存形式。在植物的冷适应中起重要作用，对于人类是一种功能性低聚糖，具有抑制肠道有害菌群增殖、改善排便功能、防止便秘、保护肝脏、降血压和血脂、增强机体免疫力等功能［1－3］，其潜在的应用价值及巨大的经济效益不容忽视。在草石蚕的肉质块茎中含有水苏糖［4］。

提取高纯度的水苏糖是其应用的基础，是研究的热点。目前，主要为物理法：水提法和醇沉法［5，6］。得到的水苏糖提取物中含有蔗糖、葡萄糖等非功能糖，其含量占总糖的30%左右；这些非功能糖不易分离。生物法如曲霉、乳酸菌和裂褶菌辅助提取，生物法与物理方法相比可以得到纯度更高的水苏糖［7－9］。

黑曲霉（Aspergillusniger），是重要的工业发酵菌种［10］。食品工业上用作发酵菌种，如用于食醋生产制曲、麸曲法白酒生产制曲、柠檬酸发酵等。本研究根据微生物优先利用单双糖的特性［11，12］，利用黑曲霉对草石蚕提取物进行发酵；较大限度地除去单双糖，保留水苏糖，提高水苏糖的纯度。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

草石蚕根茎：购于甘肃镇原县，洗净晒干含水量8.0%；黑曲霉：购自济宁玉园生物科技有限公司。

水苏糖、棉籽糖（浓度98.0%）：Sigma公司；乙腈（色 谱 纯）：RCI Labscan Limited 公 司；超 纯 水：Millipore制备；D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、D301大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂：安徽皖树化工销售有限公司；所有溶剂和样品溶液均用0.45μm微孔滤膜过滤；葡糖糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、盐酸、氢氧化钠、活性炭（粉）：均为分析纯。

1.2 仪器与设备

ME204E型万分之一电子天平 Mettler Toledo公司；百分之一电子天平 上海佑科仪器仪表有限公司；DHG－9070A型鼓风干燥箱 上海慧泰仪器制造有限公司；XW－80A型旋涡混合器 上海精科实业有限公司；数显电子恒温水浴锅 江苏省金坛市宏华仪器厂；GL－21M型高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；THZ－82A型水浴恒温振荡器 金坛市华城开元实验仪器厂；RE－201型旋转蒸发仪 上海申生科技有限公司；LGJ－1型冷冻干燥机 上海医用分析仪器厂；Waters 600高效液相色谱仪、示差折光检测器 美国 Waters公司；Waters ZORBAX NH2色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；Milli－Q 超纯水制备器 美国Millipore公司。

1.3 方法

空白样的制备：参考叶春华等［13］的方法并稍作修改。具体为：称取洗净干燥的草石蚕，用水提取其中的水溶性多糖，料液比（g/mL）为1∶15；提取温度为75℃，提取时间为75min。

1.3.1 带渣发酵对水苏糖浓度的影响

按以上方法进行得到空白样后，A1为过滤去除草石蚕残渣的提取滤液；A2为不进行过滤处理，接种量为提取液重量0.02%的黑曲霉，30.0℃恒温静置培养48.0h，过滤得到发酵液A1和A2。

1.3.2 蔗糖酶抑制剂对水苏糖浓度的影响

按照1.3.1实验中不进行过滤处理，接种量为提取液重量0.02%的黑曲霉，向提取物B1中添加提取液重量0.01%的乙二胺四乙酸二钠（EDTA－2Na）；向提取物B2中添加提取液重量0.01%的抗坏血酸（Vc），向提取物B3中添加等质量的水作为空白对照，30.0℃恒温静置培养48.0h，过滤得到发酵液B1，B2和B3。

1.3.3 发酵培养方式对水苏糖浓度的影响

按照1.3.1实验中不进行过滤处理，接种量为提取液重量0.02%的黑曲霉，添加提取液重量0.01%的乙二胺四乙酸二钠（EDTA－2Na），提取物C1于30.0℃恒温静置培养48.0h，提取物C2于30.0℃恒温培养48.0，12.0h前为静置培养，12.0h后为液体震荡培养，转速为140r/min，过滤得到发酵液C1和C2。

1.3.4 水苏糖浓度的测定

1.3.4.1 标准液的制备

分别准确称取葡糖糖、果糖、木糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖标准品5.0，15.0，25.0，50.0mg，用乙腈－水（30/70，V/V）溶解并定容至 5.0mL，配成 1.0～10.0mg/mL的系列单标储备液；分别准确称取蔗糖、棉籽糖5.0，25.0，50.0，75.0，100.0mg，用乙腈－水（30/70，V/V）溶解并定容至 5.0mL，配成 1.0～20.0mg/mL的系列单标储备液；准确称取水苏糖25.0，100.0，250.0，400.0mg，用乙腈－水（30/70，V/V）溶解并定容至5.0mL，配成5.0～80.0mg/mL的系列单标储备液，置于冰箱0～4.0℃下保存。

1.3.4.2 混合标准溶液的制备

准确称取上述1.3.4.1各糖类标准品50.0mg，用乙腈－水（30/70，V/V）溶解并定容至5.0mL，配成10.0mg/mL的混合标准液，置于冰箱0～4.0℃下保存。

1.3.4.3 样品的制备

准确称取冷冻干燥的水苏糖0.50g，用乙腈－水（30/70，V/V）溶解并定容至5.0mL，经0.45μm 滤膜过滤，滤液供分析用。

1.3.4.4 色谱条件的选择

高效液相色谱法是检测低聚糖的主要方法之一［14］。参照王玉军等［15］和潘城等［16］的方法并稍作修改。采用示差折光检测器，选用色谱柱ZORBAX NH2柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈－水（70/30，V/V），柱温为35.0℃，流速为1.0mL/min，进样体积为10.0μL。

1.3.4.5 水苏糖的标准曲线

按上述色谱条件测定峰面积，以水苏糖浓度为横坐标，峰面积值为纵坐标，由高效液相色谱直接得到水苏糖标准曲线的回归方程：y＝159063x＋9538.6，R2＝0.9997，绘制标准曲线，见图1。

图1 水苏糖标准曲线Fig.1Standard curve of stachyose

1.3.4.6 标准品的色谱图

采用上述分析条件，所得到的标准品色谱图分离度均能达到要求，检出的样品色谱峰分离度好、峰形尖、对称性好。标准品的保留时间分别为：木糖（5.769min）、果糖（6.517min）、葡萄糖（7.077min）、半乳糖（7.483min）、蔗糖（8.153min）、麦芽糖（9.422min）、乳糖（10.289min）、棉籽糖（12.281min）、水苏糖（19.132min），标准品色谱图见图2。

图2 标准品的色谱图Fig.2Chromatogram of the standard sample

1.4 数据处理

用 OriginPro（Version 9.0）软件对数据进行处理和图表的绘制，数据代表平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 草石蚕提取液的成分分析

表1 草石蚕提取物的糖类组成Table 1Composition of saccharide in Stachys seiboibi extract%

本实验利用的水提工艺，每100.00g草石蚕干可以热提取出27.00g可溶性固形物，得率为27.00%。由表1可知，草石蚕提取物中的主要糖分为：水苏糖52.69%，蔗糖 17.99%，棉籽糖 13.07%，葡萄糖8.18%及其他糖类8.07%。

2.2 带渣对草石蚕提取物的影响

本文考察了空白样是否分离除渣对提取率的影响，结果见图3。

图3 发酵糖分变化图Fig.3Changes of carbohydrates during fermentation

由图3可知，无论是否带渣，水苏糖的含量随时间的增加而下降，在发酵12.0h时水苏糖的含量最高；带渣发酵的发酵液A2中水苏糖的含量为14.06mg/mL，不带渣的发酵液A1中水苏糖的含量为4.29mg/mL。这是因为在空白样品提取时，渣中还有残余的水苏糖没有溶出，故在除去渣后，水苏糖的含量增加不大，并开始降低；与文献［17，18］报道的带渣发酵的优势相符。在带渣的黑曲霉发酵体系中，糖类是黑曲霉的较好碳源，尤其是单糖（葡萄糖、果糖）和双糖（蔗糖、麦芽糖、乳糖）等优先被利用，能够有效地保留四糖水苏糖并进一步提高其纯度。然而，在发酵体系中超过12.0h后，水苏糖的浓度开始下降。这是因为黑曲霉分泌出蔗糖酶，蔗糖酶在40～45℃酸性介质中具有较好的热稳定性［19］，水解蔗糖的同时［20］，也将水苏糖水解为甘露三糖和果糖。因此，本实验选择带渣发酵对草石蚕中的水苏糖进行纯化。

2.3 蔗糖酶抑制剂对草石蚕提取物的影响

本文考察了乙二胺四乙酸二钠和抗坏血酸作为蔗糖酶抑制剂对草石蚕提取物的影响，结果见图4。

图4 发酵糖分变化图Fig.4Changes of carbohydrates during fermentation

蔗糖酶（EC 3.2.1.26，Sucrase），又称转化酶（invertase）或β－D－呋喃果糖苷酶（β－D－fructofuranosidase），能够不可逆地催化蔗糖水解并产生葡萄糖和果糖［21］；还可以催化棉籽糖水解生成蜜二糖和果糖，水苏糖水解生成甘露三糖和果糖，见图5。

图5 蔗糖酶催化蔗糖、棉籽糖和水苏糖水解图Fig.5The sucrase catalyzed hydrolysis of sucrose，raffinose and stachyose

部分化学试剂的存在会对酶的活性产生一定的影响。本实验测定了EDTA－2Na和Vc两种化学试剂对酶活性的影响。由图4（a，b，c）可知，EDTA－2Na和Vc均能够有效地阻止水苏糖的降解，而且体系中的棉籽糖浓度下降，两体系均大于空白的水体系。而添加了EDTA－2Na的发酵液B1中水苏糖含量在0～24.0h不断增加，在24.0h时水苏糖的含量达到最大值。

在黑曲霉发酵体系中，反应前期（＜12.0h），以水苏糖从渣中溶出为主；反应后期（＞12.0h），渣中的水苏糖含量逐渐下降，溶液中的含量上升，蔗糖酶催化糖类水解的化学反应与黑曲霉吸收利用单双糖的生化反应竞争共存。因此，添加适量的蔗糖酶抑制剂可以抑制蔗糖酶的活性，降低水苏糖的水解，提高对水苏糖的保留，从而达到纯化水苏糖的效果。

乙二 胺 四 乙 酸 二 钠 （INS 386）和 抗 坏 血 酸（INS 300）均是常见的国际允许用于食品生产的食品添加剂。EDTA对蔗糖酶天然酶和修饰酶均有抑制作用［22］；EDTA对蔗糖酶的抑制作用大于抗坏血酸［23］。因此，在 酸 性 发 酵 体 系 中，本 实 验 选 择EDTA－2Na作为蔗糖酶抑制剂与黑曲霉混合发酵对草石蚕中的水苏糖进行纯化。

2.4 发酵培养方式对草石蚕提取物的影响

本文考察了静置培养和静置－液体震荡两阶段培养方式对草石蚕提取物的影响，结果见图6。

图6 发酵糖分变化图Fig.6Changes of carbohydrates during fermentation

由图6（a，b）可知，与静置培养C1相比，静置－液体震荡两阶段培养C2条件下，黑曲霉菌丝体生长较好，水苏糖含量增加，而葡萄糖和蔗糖等单双糖含量下降，水苏糖纯化效果较好。

黑曲霉是好氧性菌类，静置培养和厌氧培养都不利于黑曲霉的生长。震荡培养可以让黑曲霉接触更多的氧气，有利于形成良好的发酵空间。丁兰平等探究不同培养方式坛紫菜自由丝状体生长及藻胆蛋白含量的影响，坛紫菜自由丝状体在摇床培养条件下生长较好，特定生长速率可达10.83%～10.89%［24］。骆军鑫等采用液体震荡－静置两阶段培养法进行灵芝液体深层发酵培养，与液体震荡培养法相比，灵芝菌丝体胞内总三萜含量提高了1.7倍左右，总三萜产量提高了2.5倍左右［25］。因此，本实验选择采用静置－液体震荡两阶段培养法对草石蚕中的水苏糖进行纯化。

综上所述，本文在上述单因素实验的基础上，得到黑曲霉发酵法提纯草石蚕中水苏糖的优化工艺为：准确称取100.0g草石蚕干，提取温度为75.0℃，时间为75.0min，料液比为1∶15提取后；接种提取液重量0.02%的黑曲霉，添加提取液重量0.01%的蔗糖酶抑制剂EDTA－2Na，采用静置－液体震荡两阶段培养方式进行发酵提取，发酵温度为30.0℃，时间为24.0h。

2.5 优化工艺的验证

通过20次平行实验，黑曲霉发酵法提纯草石蚕中水苏糖的稳定性较高。发酵液通过高效液相色谱进行检测，见图7。

图7 黑曲霉发酵液的高效液相色谱图Fig.7HPLC of the broth of Aspergillus niger

20次实验中草石蚕发酵液中单糖和蔗糖最终总量均小于总糖的3.00%，水苏糖浓度可以从52.69%提高到80.43%，重复性良好。使用OriginPro（Version 9.0）软件对水苏糖含量和单双糖含量进行相关性分析，相关系数r＝－0.746＊＊（表示相关性极显著，P＜0.01）说明二者存在很强的负相关性，即相同发酵条件下，单双糖含量越低，水苏糖含量越高。

每100.0g草石蚕干，按照上述工艺提取后，活性炭脱色，离子交换树脂进一步脱色和脱盐，真空浓缩，冷冻干燥，制备得到产物32.06g水苏糖（含量80.43%）。

3 结论

本实验条件下，接种黑曲霉，添加蔗糖酶抑制剂EDTA－2Na，采用静置－液体震荡两阶段培养方式进行发酵提取，发酵温度为30.0℃，时间为24.0h，可使糖液中单糖和蔗糖含量降至3.00%左右；水苏糖浓度可从52.69%提高到80.43%。