高效液相色谱法测定头痛宁胶囊中天麻素的含量

苑　博　马海英　王　颖

（中国医科大学附属第四医院药学部，辽宁　沈阳　110032）

头痛宁胶囊由天麻、土茯苓、制何首乌、当归、防风和全蝎六味中药制成，具有熄风涤痰、逐瘀止痛的功效，用于治疗偏头痛、紧张性头痛属痰瘀阻络证，临床效果显著[1-2]。制剂质量标准为国家食品药品监督管理局药品标准 （WS-11211(ZD-1211)-2002-2012Z）。标准中除常规检查和理化鉴别外，对制剂中的大黄素（来源于制何首乌）含量设定了质控限值[3]。制剂中天麻是方中主药，味甘性平，归肝经，具有息风止痉，平抑肝阳，祛风通络的功效，主要成分为天麻素[4-6]。为有效控制头痛宁胶囊质量，建议标准中增加对主药天麻的含量限值控制。参考相关文献方法[7-9]，本文建立了HPLC法测定头痛宁胶囊中的天麻素含量，方法简便快速、准确度高、专属性强，可用于头痛宁胶囊中的天麻素的测定，为提高头痛宁胶囊质量标准提供依据。

1　仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；电子分析天平（AL204型，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；超声波清洗器（KQ-500DE型，昆山市超声仪器有限公司）；天麻素标准品（中国药品生物制品检定所，批号：110807）；乙腈（色谱纯，美国Merck公司）；头痛宁胶囊（陕西步长制药有限公司，批号为170456、170522、170622、170729、170807）。其他试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈－0.1%冰醋酸 （2∶98 （v/v））；流速1.0 mL·min-1；柱温40℃；检测波长220 nm；样量20 μL。2.2对照品溶液的配制 精密称取天麻素对照品13.10 mg，置于10 mL容量瓶中用流动相溶解定容，制成浓度为1.31 mg/mL的天麻素对照品储备液。分别取适量天麻素对照品储备液用流动相稀释成浓度为1.31、6.55、13.10、26.20、52.40和104.80 mg/L的天麻素对照品溶液。

图1　空白溶液

2.3供试品试液的制备 取头痛宁胶囊内容物，混匀研细，精密称取0.5 g置于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇20 mL混匀，超声波提取15 min，超声波提取温度为40℃，冷却定容，过0.45 μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

2.4阴性试液的制备 取头痛宁胶囊处方中除天麻外的其他中药材，按照制剂标准[3]比例和工艺制成不含天麻的阴性对照制剂，依据供试品溶液项下方法制备，过0.45 μm滤膜，取续滤液作为阴性对照溶液。

2.5专属性试验 分别将空白溶剂、天麻素对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液按色谱条件分析，结果见图1。结果表明，供试品溶液和对照品溶液在保留时间约6.1 min处检出天麻素色谱峰，而阴性对照溶液在此保留时间没有色谱峰，表明在本色谱条件下，头痛宁胶囊中的其他成分对天麻素的测定无干扰，理论塔板数按天麻素计＞2000，头痛宁胶囊中天麻素的高效液相色谱图见图1（3），天麻素色谱峰与相邻峰间分离度大于1.5。

2.6线性关系考察 分别吸取浓度为1.31、6.55、13.10、26.20、52.40和104.80 mg/L的天麻素对照品溶液按照2.1项下色谱条件分析，测定天麻素色谱峰面积，以峰面积A为纵坐标，质量浓度C（mg/L）为横坐标，绘制标准曲线方程。标准曲线方程为A=27.9454C+5.9771，相关系数为0.9998，天麻素在1.31~104.80 mg/L线性关系良好。

2.7检测限和定量限 将天麻素对照品溶液逐级稀释，按照2.1项下色谱条件分析，以3倍噪音时的天麻素浓度为方法检测限，以10倍噪音时的天麻素浓度为方法定量限，结果天麻素的检测限和定量限分别为0.03 mg/L和0.10 mg/L。

2.8精密度试验 取13.1 mg/L的天麻素对照品溶液，按2.1项下色谱条件分析，重复进样6次，测定峰面积，计算精密度，结果天麻素色谱峰面积的RSD%为0.55%，精密度良好。

2.9重复性试验 取头痛宁胶囊样品（批号170807） 按照2.3项下供试液制备方法制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件分析，测定峰面积，计算天麻素含量。结果天麻素的平均含量为（0.48±0.01） mg，RSD为3.06%（n=6），方法的重复性良好。

2.10稳定性试验 将制备好的头痛宁胶囊样品（批号170807） 供试液，分别在0、1、2、4、8、12和24 h进样，记录天麻素色谱峰峰面积。结果峰面积RSD为1.79%，表明供试液均在24 h内稳定性良好。

2.11回收率试验精密称取头痛宁胶囊（批号170807）各约0.5 g，分别加入天麻素对照品溶液（浓度为1.31 mg/mL） 25 μL、100 μL和250 μL，制成含高中低3个浓度的样品，每个浓度制备3份样品，按照2.3项下制备供试液，液相色谱分析，计算回收率。结果，天麻素在0.033 mg、0.131 mg和0.328 mg 3个水平的平均回收率均在95%~105%，RSD<5%，回收率测试结果见表1。

表1　头痛宁胶囊中天麻素测定的加标回收率结果

2.12样品含量测定 选用5批不同批号的头痛宁胶囊，参照2.3项下供试液制备方法制备后HPLC分析，结果5批样品中天麻素含量分别为0.48~0.51 mg/粒，结果见表2。参照中国药典要求[4]，天麻中天麻素含量不能低于0.2%，头痛宁胶囊制剂标准中规定每粒胶囊中应含有0.27g天麻或天麻的提取物，以80%的转移率计，制剂中天麻素不应少于0.43 mg/粒。

表2　样品中天麻素的测定结果　（n=6）

3　讨论

天麻素属于酚甙类物质，分子量小、极性较大[10]。本研究比较了热回流和超声波两种提取方法，超声波提取操作简单、省时，而且天麻素受热60℃以上含量会下降，有新物质生成[11-12]，因此采用超声波法提取。本实验比较了水、50%乙醇和75%乙醇三种提取溶剂，三种溶剂均能将天麻素提取完全，但水和50%乙醇提取液过滤较困难，故采用75%乙醇做提取溶剂。比较了25、50和100倍提取溶剂的提取效率，50倍提取溶剂即可将天麻素提取完全。考察了超声波提取时间和提取温度，超声波提取15 min，提取温度为40℃可完全提取天麻素。因此最终确定提取方法为：用50倍75%乙醇，超声波提取15 min，提取温度为40℃。采用本法提取头痛宁胶囊中的天麻素，结果准确可靠。

本实验参考文献[7-10]方法优化色谱条件，比较了甲醇-水和乙腈-水系统，在220n m波长下，乙腈-水系统更易达到平衡。在水中加入少量醋酸可使得色谱峰峰形更好，最终选用乙腈-0.01%冰醋酸（2∶98）为流动相，柱温40℃，在此条件下，天麻素色谱峰保留时间约为6.1 min，与邻近色谱峰分离度良好，天麻素色谱峰峰形良好。

中药制剂质量标准中的含量测定项首选君药，天麻为头痛宁胶囊方中君药，应设立天麻的有效成分为标准中含量测定项，建议头痛宁胶囊质量标准中增加对天麻主要成分天麻素的含量限值控制，参考本实验研究结果，建议头痛宁胶囊中天麻素不应少于0.43 mg/粒。本法可以快速分析头痛宁胶囊中的天麻素，测定结果不受药材中其他物质的干扰，方法简便，结果准确，为进一步提高头痛宁胶囊的质量控制方法提供参考。