人心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒的方法学评价及在急性冠状动脉综合征患者诊断中的临床应用

刘亚巍，尚进，洛佳坤，蒋知新，彭旭东，衣志勇

(1.中央军委联合参谋部警卫局保健处，北京 100017；2.中国人民解放军医学院、中国人民解放军总医院；3.中国人民解放军第三○五医院)

心肌生物标志物通常是心肌细胞内形成胞内结构的蛋白质组分。在外界各种理化因素的刺激下，心肌细胞有可能受到损伤，这些标志物可以由细胞释放进入血液循环[1-3]。人心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)是心肌生物标志物的一种，它在人心肌细胞中的含量非常高，H-FABP是这些可溶性蛋白质的一种，论其含量，大概占到了4%～8%。H-FABP的分子量相对比较小，当心脏内的心肌细胞在外界理化生各种不良因素的刺激下，受到不同程度或轻或重的损伤的时候，心肌细胞的细胞膜的通透性必然会较前有所增加，H-FABP则可以穿过这样的细胞膜，随机地弥散到到胞外。因此，当心肌细胞受损时，H-FABP是最早由心肌细胞释放而进入外周血液循环的生物标志物之一[4]。

H-FABP是一种非酶类的蛋白质，如果要想对其进行定量检测，则需要使用免疫化学的相关测定方法，在众多的免疫化学测定方法当中，被应用的最多的最广泛的最普及的是抗原捕获型酶联免疫吸附测定法(ELISA),也包括竞争性免疫分析法和免疫荧光测定法。在目前这些免疫化学的测定方法中，基本所有的方法都运用了单克隆抗体(MAb)。然而，这些检测方法具有一个共同的缺点，就是耗时较长(至少需要45 min)，导致检测结果的获取速度过慢。

近来，本研究组联合兰州生物制品研究所根据《体外诊断试剂的临床研究技术指导原则》[5]共同研发了H-FABP的 ELISA检测试剂盒。本研究目的在于评估该ELISA试剂盒的检测性能指标，以及临床可接受性。

1　材料与方法

1.1主要材料

1.1.1 病例来源选择从2010年3月至2016年3月期间，就诊于中国人民解放军总医院并疑诊急性冠状动脉综合征(ACS)而收入院治疗的患者。纳入标准：①具有胸痛、喘息、黑懵等ACS相关的临床症状；②患者因相关不适就诊于门急诊，在接诊医生进行相关评估后，怀疑其诊断为ACS，从而进入相关科室进行治疗；③从患者胸痛发作的那一刻开始计时，到患者进入相关科室进行治疗，如果这个持续的时间小于12 h，那么该患者可以纳入；④从患者发病的那一刻开始计时，到患者进行第一次抽血，如果这个持续的时间小于12 h，那么该患者可以纳入。排除标准：如果患者有严重呼吸道相关、胃肠道相关、尿路相关、中枢以及外周神经相关、全身血管内的血液相关疾病，或者在最近5年之内，患者曾经患有属于自身免疫系统相关的结缔组织病、以及可能发生于全身各处的良性或恶性肿瘤等，或者在近2周以内，患者受到了重大的创伤，以及不慎获得了感染性疾病。经过筛选，共纳入160例符合入选条件的患者。在相同的起止时间内，选取80例在中国人民解放军第三○五医院进行健康查体人员的相关信息。

1.1.2标本及采集被接诊医生怀疑是ACS的患者以及健康人群在到达医院查体时，立即抽取3 mL外周静脉全血。储存外周血的装置为肝素或分离胶真空采血管，将血浆或血清离心分离，转速为3000 r/min。离心结束后将外周血保存于已经购买并准备好的冻存管中，冻存管的容量为2 mL，再将冻存管保存到已经购买好的冰箱内，并将温度设置为-40 ℃。

1.1.3主要试剂与仪器使用的H-FABP检测试剂盒(ELISA法)包括为兰州生物制品研究所自主研发产品与荷兰HBT公司已上市产品。Elecsys 2010全自动免疫分析仪为美国 Roche 公司产品，D×C 800型全自动生化分析仪为美国 Beckman coulter 公司产品。

1.2方法

1.2.1方法比较实验从冰箱内拿出保存好的血浆样本，将其放在室温的环境中，随着时间的推移，样本会自动充分地混合，再使得该样本平均分为2份，再拿出上文提到的国产和荷兰两种H-FABP检测试剂盒，认真研读各自的使用说明后，使用两种试剂盒对上述已经均分好的两份样本进行检测，按照使用说明上的步骤计算出结果，再运用统计学原理，对结果进行相关性分析。

国产生物试剂盒测定H-FABP的操作步骤为：试剂盒内的试剂于2～8 ℃冰箱内保存，使用前从冰箱内取出，使其升至25 ℃的室温。将试剂盒中配套的浓缩酶标洗涤液用去离子水稀释备用，稀释比为1∶20；血浆保存于-40 ℃，实验前取出并平衡至室温25 ℃。从试剂盒内拿出酶标洗液稀释液，取出的体积为0.5 mL，再参照说明书内的步骤，取出一定量的参比品干粉，使用实验室内制备好的去离子水对其进行溶解，接下来的重要步骤是对其进行稀释，稀释所采用的方法为对倍稀释，最终本组得到了成倍稀释好的参比品，他们的的终浓度依次为：50 μg/L、25 μg/L、12.5 μg/L、6.25 μg/L、3.125 μg/L、1.5625 μg/L、0.781 25 μg/L、0.390 625 μg/L；再拿出已经购置好的移液枪，用其分别吸取样本和已经释好的参比品，此时需要吸取的体积为100 μL，再利用移液枪将这两种样本共同放入反应孔里面。拿出封板膜将试管封好，使用振荡器将试管内的液体混匀，再将其放进37 ℃的温箱，进行30 min的孵育；孵育结束后用洗板机洗涤5次，将反应板放在吸水纸上拍干；再向每一个反应孔内加入100 μL的酶结合物，使用振荡器将其混匀，再放进37 ℃的温箱，进行30 min的孵育；利用洗板机将反应板进行5次洗涤，将反应板放在吸水纸上拍干；向每个反应孔中先后加入底物A、B液，用振荡器混匀后置于37 ℃温箱，进行20 min的孵育；到时间后，向每个反应孔中加入50 μL的终止液，利用振荡器将其混匀；将反应板放入酶标仪内，测定每个反应孔在450 nm入射光下的吸光度值。利用CurveExpert、EXCEL软件绘制标准曲线，求出样本浓度。

荷兰HBT公司试剂盒测定H-FABP的操作步骤为：实验开始前从2～8℃的冰箱内取出试剂，使其升至25 ℃的室温。拿出试剂盒内的配套浓缩洗涤液，按照1∶20的比例对配套浓缩液进行稀释，对于已经稀释好的洗涤液，需要对其妥善保存，日后使用时会非常的方便快捷；需要继续取出试剂盒中的浓缩样本稀释液，接下来的重要步骤是对其进行稀释，需要注意的是稀释的比例为1∶10，类似的需要对其妥善保存，日后使用时会非常的方便快捷；此时需要继续拿出试剂盒内的浓缩酶标二抗，使用去离子水对其按照1∶5的比例进行稀释；之前已经收集好的血浆样本保存于-40 ℃的冰箱内，在实验的这一步，此时需要将其取出，放在室温25 ℃的环境下。继续取出试剂盒内的样本稀释液，下面的重要步骤是对标准品进行稀释，稀释的过程需要一直持续多次，经过稀释后的标准品的终浓度分别为：25 000 ng/L、10 000 ng/L、4000 ng/L、1600 ng/L、640 ng/L、256 ng/L、102 ng/L、0 ng/L。后面添加二抗、显色、孵育、测定等步骤参照兰州试剂盒步骤。

1.2.2精密度实验先从冰箱中取出保存备用的3份标本，这3份标本的浓度各有不同，可以认为是高、中、低3个浓度，再拿出兰州H-FABP试剂盒，下面的重要步骤是连续检测，检测对象是上述3个标本，检测次数为20次，得到检测的结果以后，在数据统计方面需要的是H-FABP的平均值，还有方差，有了这两个数据，进而求出批内变异系数，这里提供公式：变异系数(CV)=方差/平均值×100%。从冰箱中取出保存备用的3份标本，这3份标本的浓度各有不同，可以认为是高、中、低3个浓度。重要步骤是使用国产试剂盒连续检测，检测对象是上述3个标本，检测方式为每天检测1次，连续20 d，同理得到检测的结果以后，在数据统计方面需要的是H-FABP的平均值，还有方差，有了这两个数据，进而求出批间变异系数。

1.2.3回收实验先从冰箱中拿出保存备用的5份血浆，从中取出一定量的体积，这里实验中所需要的体积为0.9 mL，再严格遵照随机的原则，从这5份血浆中选出4份，分别加入H-FABP的标准液，所加的标准液的体积为0.1 mL，而需要的浓度要特别注意保持正确，分别为50 μg/L、25 μg/L、12.5 μg/L、6.25 μg/L，而刚才经过挑选被剩下的那一份标本，根据实验对照的原则，需要做的是向其中加入一定量的0.9%氯化钠注射溶液，这里的一定量指的是0.1 mL，这样操作之后的这份标本就被认定为对照组。下面的重要步骤是混匀，混匀的对象是上述的经过配置操作后的所有的5份标本，拿出国产H-FABP试剂盒进行检测，检测对象为刚才提到的5份标本，检测的方式为连续10次检测，注意这里使用的试剂盒是要求型号相同的，得到检测的结果以后，在数据统计方面需要的是平均，进而求得回收率，这里提供了公式：回收率=(加入标准液的血浆测定值-加入0.9%氯化钠注射溶液的血浆测定值)/加入量×100%。

1.2.4干扰实验

1.2.4.1血红蛋白液本研究所使用的血红蛋白液是自行制备。制备的方法是机械溶血，然后再利用美国贝克曼库尔特ACT5DIFCP。接下来的重要步骤是检测浓度，血红蛋白液检测的浓度为160 g/L；胆红素浓缩液：本研究中使用的胆红素浓缩液是本组购买胆红素干粉，对干粉进行溶解，再参照本研究上述步骤中提到的方法，对其进行稀释则可。然后本组再利用美国贝克曼库尔特D×C 800仪检测胆红素浓缩液，检测的浓度为845 μmol/L；脂肪乳注射液(20%)：本研究中使用美国贝克曼库尔特D×C 800仪检测所购买的脂肪乳注射液浓度，检测的浓度为488 mmol/L。

1.2.4.2试验组内的样本本研究中的样本使用的是肝素抗凝血浆，来源于高龄健康志愿者(正常)和患者(异常)，使用0.9%氯化钠注射溶液配制干扰物，使它们的浓度各自不会相同。接下来的重要步骤是混合，这里混合的对象为上述的样本和试验全血，本研究将比例设置为1∶9，得到血浆样本。而其中的溶血血红蛋白的浓度按照本研究要求被控制为16 g/L、15 g/L 、14 g/L 、13 g/L 和12 g/L，总胆红素(TBIL)被严格控制为84.5 μmol/L、42.3 μmol/L、21.2 μmol/L、10.6 μmol/L 和5.3 μmol/L，三酰甘油(TG)被严格控制为48.8 mmol/L、16.3 mmol/L、5.4 mmol/L、1.89 mmol/L和0.6 mmol/L。再按1∶9的比例将0.9%氯化钠注射溶液加入正常和异常血浆中混合均匀作为对照组。

1.2.4.3影响度的计算采用兰州生物制品研究所研制的H-FABP试剂盒测定对照血浆和加入干扰物的血浆(试验组)中的H-FABP浓度各2次。得到检测的结果以后，在数据统计方面取平均值，进而求得影响度。关于计算影响度的方法，本研究首先需要选定一个标准，这里以对照组的测定值作为标准，按照上文提到的设计，没有加入干扰物质的血浆可以作为对照组，由此进一步求出影响度(%)。影响度=(加入干扰物的血浆测定值-未加入干扰物的血浆测定值)/未加入干扰物的血浆测定值×100%。

2　结果

2.1方法比较实验经过上述步骤以后，本研究得到了240份标本的检测结果。进行相关性分析显示，国产试剂盒(Y)与荷兰试剂盒(X)检测的H-FABP值之间的回归方程为：Y=2.5943X+3.2238，R2=0.9252，相关系数R=0.96，P<0.001(见图1)。

图1　国产试剂盒与荷兰试剂盒测定血H-FABP值的

2.2精密度实验国产试剂盒检测H-FABP的批内变异系数(CV)：低值为6.4%，中值为8.2%，高值为5.7%(见表1)；批间CV：低值4.1%，中值为3.9%，高值为4.1%(见表2)。以上这些经过充分计算的结果都充分说明了国产试剂盒检测H-FABP的重复性是非常好的。

表1　国产试剂盒检测H-FABP的批内精密度实验结果

注：H-FABP为心脏型脂肪酸结合蛋白，CV为变异系数，下表同

表2　国产试剂盒检测H-FABP的批间精密度实验结果

2.3回收实验当H-FABP标准溶液的浓度各有不同时，各自浓度所对应的回收率的范围是93.0%～105.7%(见表3),说明国产试剂盒检测H-FABP的准确度良好。

表3　国产试剂盒检测H-FABP的回收实验结果

2.4干扰实验

2.4.1TBIL对H-FABP的干扰实验当TBIL的浓度各有不同时，各自浓度对正常水平的H-FABP的影响度的范围是-9.57%～2.39%(见表4)；当TBIL的浓度各有不同时，各自浓度对异常水平的H-FABP的影响度的范围是-20.71%～7.43%(见表5)。说明当TBIL的浓度较高对H-FABP的检测有一定影响。

表4　TBIL对正常水平H-FABP的影响

注：TBIL为总胆红素，下表同；H-FABP对照值为2.09 μg/L

表5　TBIL对异常水平H-FABP的影响

注：H-FABP对照值为98.64 μg/L

2.4.2TG对H-FABP的干扰实验当TG的浓度各有不同时，各自的浓度对正常水平的H-FABP的影响度得范围是-6.66%～10.13%(见表6)。当TG的浓度各有不同时，各自的浓度对异常水平的H-FABP的影响度的范围是5.07%～10.93%(见表7)。

表6　TG对正常水平H-FABP的影响

注：TG为三酰甘油，下表同；H-FABP对照值为1.49 μg/L

表7　TG对异常水平H-FABP的影响

注：H-FABP对照值为91.53 μg/L

2.4.3溶血血红蛋白对H-FABP的干扰实验当溶血血红蛋白的浓度各有不同时，各自的浓度对正常水平的H-FABP的影响度的范围是-9.18%～8.16%(见表8)。当溶血血红蛋白的浓度各有不同时，各自的浓度对异常水平的H-FABP的影响度的范围是-9.27%～9.83%(见表9)。

表8　溶血血红蛋白对正常水平H-FABP的影响

注：H-FABP对照值为0.98 μg/L

表9　溶血血红蛋白对异常水平H-FABP的影响

注：H-FABP对照值为96.70 μg/L

3　讨论

H-FABP的临床检测水平近些年有了巨大的进步，检测的速度、效率和灵敏度自然也会跟随着技术进步而提高[7]。目前检测技术比较成熟的是双抗体夹心ELISA方法。本组在2004年初步地探讨了H-FABP在正常人体内的参考值范围，利用酶联免疫吸附法(ELISA)对126例健康人群的血清H-FABP数值进行了测定，而且，本研究团队在进行测定工作的同时，挑选了三种心肌标志物作为实验的对照，这三种标志物是心肌肌酸激酶同工酶(CK-MB)、血浆肌钙蛋白I(cTnI)、血浆肌红蛋白(Myo)。经过一系列的实验之后，得出H-FABP在正常人体内的血清浓度的范围为(3.79±3.52)μg/L，而且，这个数据的范围不随着人的性别和年龄的不同而变化。我国居民血清H-FABP正常参考值范围为 0～10.83 μg/L[8]。相比于在临床上已广泛使用、检测水平获得业内认可的荷兰试剂盒，本研究使用的兰州生物制品研究所研发的检测试剂盒成本十分低廉，是荷兰试剂盒检测成本的五分之一。

在精密检测的业界内，大型精密检测仪器是一项重要的内容。精密度是在规定的条件下获得的独立测定结果之间的接近程度，亦定义为是测定值与平均值之间的符合程度，它可以表示重复测定值之间的一致性，是反映随机误差的一个参数之一。精密度分为批内精密度与批间精密度。CV反映了精密度的好坏，CV数值越小，精密度越好，反之则越差。CV包括：批内CV、批间CV，它的含义是整个分析体系的可重复程度[9]。美国化学发光免疫分析法临床检验室内质量控制文件(CLIA′88)中规定的CV的指标为10%。在差不多30年以前，CLIA非常特别且专门地针对大型精密仪器制定了一系列的文件，其中一份文件的名字叫做EP5-A2，文件规定：批内CV和批间CV分别应为CLIA指标的1/4和1/3[10]。本研究显示，国产试剂盒和荷兰试剂盒的检测结果存在一些差异，但仍保持有良好的相关性(R=0.96)。精密度实验和回收率实验的结果说明了国产试剂盒检测H-FABP在稳定性和准确度方面十分的优秀。对于干扰试验来说，本研究显示，当总胆红素、三酰甘油和溶血血红蛋白的血清浓度达到比较高的水平时，对测定结果可以产生直接的影响，对正常值尤其如此。

本研究显示，就检测相关性来说，兰州生物研究所生产的H-FABP检测试剂盒与荷兰HBT公司生产的H-FABP检测试剂盒具有非常好的检测相关性，国产试剂盒具有价格低廉、检测快速等优势，拥有巨大的潜在临床应用价值。