AR与Cyclin D1在非特殊型浸润性乳腺癌不同分子分型中的表达及与临床病理特征的关系

陈春兵，周正平，杨　华，袁　丹，刘俊江

(1.遵义医学院 病理学教研室，贵州 遵义　563099；2.遵义医学院 电镜室，贵州 遵义　563099；3.遵义医学院附属医院 病理科，贵州 遵义　563099；4.遵义医学院第三附属医院 影像科，贵州 遵义　563000)

乳腺癌是常见的女性恶性肿瘤之一，据统计，2017年美国新发乳腺癌252 710例，占女性全部新发恶性肿瘤的30%，是发病率最高的女性恶性肿瘤。在我国，随着乳腺癌发病率明显增高及年轻化，在某些城市和地区，现已成为发病率最高的女性肿瘤[1-2]。

在临床病理诊断过程中，根据雌激素受体(estrogen receptor ，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)、人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor -2，HER2)和 Ki-67等免疫组织化学标记物在乳腺癌组织中的表达情况，将乳腺癌进行病理分子分型：①Lumial A型(ER+/PR+、HER2-、Ki-67< 20 %)；②Lumial B型：包括HER2阴性型(B1型)[ER+/PR +、HER2-、Ki-67≥20%]和HER2阳性型(B2 型) [ER+/PR+、HER2+]；③HER2过表达型(ER-、PR-、HER2+)；④基底细胞样型/TNBC[ER-、PR-、HER2-、CK5/6+/EGFR+]，习惯统称为TNBC[3]。不同分子分型的乳腺癌患者需要采取不同的治疗方案。

雄激素受体(androgen receptor，AR)、Cyclin D1分别为甾体激素激活转录因子和细胞周期蛋白。近年来研究发现，AR和Cyclin D1与乳腺癌的发生发展有关[4-5]，但关于二者与浸润性乳腺癌分子分型及临床病理特征关系的研究较少。因此，本研究拟选取88例非特殊型浸润性乳腺癌患者存档的石蜡组织，通过免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)技术Envision二步法联合检测AR与Cyclin D1蛋白在其中的表达情况，研究二者在非特殊型浸润性乳腺癌不同分子分型中的表达及其与临床病理特征的关系，为临床判断乳腺癌生物学行为、制定乳腺癌患者个体化治疗方案提供一定的实验依据。

1　材料与方法

1.1标本来源收集遵义医学院附属医院病理科2013年9月至2017年8月存档的非特殊型浸润性乳腺癌石蜡标本88例，均经病理科两位老师重新阅片确诊。所有患者均为女性。根据2012年WHO乳腺肿瘤组织分类[6]：Ⅰ级13例，Ⅱ级57例，Ⅲ级18例。年龄：27～76岁，中位年龄49.86岁；肿瘤大小：<2 cm 35例，2～5 cm 33例，>5 cm 9例；腋窝淋巴结转移：有转移46例，无转移42例；临床分期：T1期26例，T2期42例，T3期8例，T4期12例。所有患者术前均未行放化疗等治疗。根据ER、PR、HER2、Ki-67等免疫组化表型进行分子分型：Luminal A型16例，Luminal B型37例，HER2过表达型13例，TNBC 22例。

1.2主要试剂鼠抗人AR单克隆抗体、兔抗人Cyclin D1单克隆抗体、免疫组化MaxVisionTM检测试剂盒(鼠/兔)、抗原修复缓冲液(粉剂型柠檬酸法)、缓冲液(PBS磷酸盐法)、Ultra DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。鼠抗人AR、兔抗人Cyclin D1工作浓度均为1∶100。

1.3方法将存档的非特殊型浸润性乳腺癌组织蜡块4 μm厚连续切片，然后进行免疫组化Enivision 法染色，苏木精复染，透明封片。用前列腺增生组织作为AR蛋白表达的阳性对照，用套细胞淋巴瘤组织作为Cyclin D1蛋白表达的阳性对照，用PBS代替一抗作为非特殊型浸润性乳腺癌组织阴性对照。组织抗原均采用高压修复，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书要求操作(见图1)。

A：AR蛋白阴性对照(×400)； B：AR蛋白阳性对照(×400)； C：Cyclin D1蛋白阴性对照(×400)； D：Cyclin D1蛋白阳性对照(×400)。图1　AR与Cyclin D1蛋白阴性对照及阳性对照

1.4结果判读AR蛋白主要表达于细胞核，阳性细胞染色呈棕黄色或棕褐色，根据阳性细胞的百分比进行判定[7]：阳性细胞数<10%为阴性表达；阳性细胞占数10%～25%为弱阳性表达；阳性细胞数占26%～50%为阳性表达；阳性细胞数>50%为强阳性。本实验将阴性表达定为阴性(-)，将弱阳性、阳性和强阳性表达定为阳性(+)。Cyclin D1蛋白主要表达于细胞核，采用 Fromowitz[8]阳性细胞半定量分级法：阳性细胞数<10%为0分，10%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；细胞染色强度，阴性为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。本实验根据阳性细胞数与相应染色强度之和判定染色结果：0～1分定为阴性(-)，2～7分定为阳性(+)。

1.5统计学处理采用SPSS 20.0对数据进行统计分析。运用χ2检验和秩和检验，不符合χ2检验条件的使用Fisher确切概率法，多组组间比较有差异者进行两两比较，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2　结果

2.1AR与Cyclin D1蛋白在非特殊型浸润性乳腺癌不同分子分型组织中的表达情况88例非特殊型浸润性乳腺癌组织中，AR蛋白阳性表达率为79.54%(70/88)，在Luminal A型中表达最高，TNBC中表达最低，Luminal B型中表达高于HER2过表达型中的表达，4组总体比较，差异具有统计学意义(P<0.001)；两两比较，仅在TNBC与其余各分子亚型中的表达之间比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；Cyclin D1蛋白阳性表达率为60.22%(53/88)，在Luminal B型中表达最高，TNBC中表达最低，Luminal A型中表达高于HER2过表达型中的表达，4组总体比较，差异有统计学意义(P<0.001)；两两比较，仅在TNBC与Luminal A型、Luminal B型中的表达之间比较，差异有统计学意义(P<0.05，见表1、图2)。

表1AR与Cyclin D1蛋白在非特殊型浸润性乳腺癌不同分子分型组织中的表达(n=88)

分子分型例数AR阳性数阳性率PCyclin D1阳性数阳性率PTNBC22836.40418.18Luminal A1616100.00∗<0.0011168.75∗<0.001Luminal B373697.30∗3183.78∗HER2过表达131076.92∗753.85

*：与TNBC型比较，P<0.05。

A：AR蛋白阳性表达(×400)；B：Cyclin D1蛋白阳性表达(×400)。　　图2　AR与Cyclin D1蛋白在非特殊型浸润性乳腺癌组织中阳性表达

2.2AR与Cyclin D1蛋白在非特殊型浸润性乳腺癌中的表达与临床病理特征的关系AR蛋白在组织学I级中阳性表达率最高，III级中表达最低，总体比较，差异具有统计学意义(P<0.001)；但仅在组织学III级与I、II级中的表达之间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。AR蛋白在临床T1期中表达最高，T2期中表达最低，T4期中的表达高于T3期，总体比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；但仅在T2期与T1期中的表达之间比较，差异有意义(P>0.05)。AR蛋白表达与患者年龄、肿瘤大小、淋巴转移无关。Cyclin D1蛋白在组织学II级中的表达最高，III级中表达最低，总体比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；但仅在组织学III级与I、II级中的表达之间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。Cyclin D1蛋白表达与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期无关(P>0.05，见表2)。

表2AR与Cyclin D1蛋白在非特殊型浸润性乳腺癌中的表达与临床病理特征关系(n=88)

临床病理特征例数AR阳性数阳性率(%)PCyclin D1阳性数阳性率(%)P组织学分级　Ⅰ级1313100.00★840561.54★　Ⅱ级574985.96★<0.00170.18★0.006　Ⅲ级18844.4427.78患者年龄(岁)　≤50453782.220.524272660.000.964　>50433376.7460.47肿瘤大小(cm)　<2352880.002425468.57　2～5333681.820.59256.820.338　>59666.6744.44淋巴结转移　有463780.430.829292463.040.572　无423378.5757.14临床分期　T1262496.00◆16246761.54　T2422866.670.01857.140.839　T38787.5075.00　T4121191.6758.33

★：与组织学Ⅲ级比较，P<0.05；◆：与临床T2期比较，P<0.05。

2.3非特殊型浸润性乳腺癌组织中AR与Cyclin D1蛋白表达的相关性分析AR与Cyclin D1蛋白二者之间的表达呈正关联，关联强度是0.782(χ2=3.545，γ=0.782，P<0.001)，95%CI：[0.473，0.958](见表3)。

表3AR与Cyclin D1蛋白在非特殊型浸润性乳腺癌组织中的表达的相关性分析(n=88)

ARCyclin D1+-P+4921<0.001-414

3　讨论

随着乳腺癌发病率上升及年轻化，已严重影响着我国女性的生命健康及生活质量。乳腺癌的治疗手段主要包括：手术、放疗、化疗及内分泌治疗，目前，乳腺癌的生物分子靶向治疗已针对性应用于临床。所以，乳腺癌的分子分型结合发病机制、治疗及预后的研究已成为热点。

流行病学调查研究发现，遗传、流产、肥胖和激素等是乳腺癌的高危因素，其中，长期高水平的雌激素与乳腺癌的发生更密切，因此，乳腺癌是一种激素依赖性肿瘤。但随着对乳腺癌发病机制的深入研究显示，雄激素(androgen，A)及其受体(AR)对乳腺癌的发生和发展起重要作用[9]。A是一种来源于女性卵巢和肾上腺皮质的激素，通过与细胞质中的AR结合，使AR被激活，促进细胞分化及增殖，发挥调控女性性腺的生长和发育的作用。研究表明，AR能促进ER阴性的乳腺癌细胞增殖；但在ER阳性的乳腺癌中，AR通过拮抗ER信号的生长刺激作用，从而发挥抗增殖作用。AR在超过三分之一的TNBC中有表达，运用药物性AR阻断剂比卡鲁胺能有效抑制AR阳性的TNBC细胞的增殖，使肿瘤生长减慢，使患者的无进展生存期延长[10]。

屠世晔等[11]报道了239例乳腺癌患者中，AR在 Luminal A 型、Luminal B型及HER2过表达型乳腺癌中均呈过表达，而在TNBC中呈低表达。Gasparini等[12]指出，与ER阳性的乳腺癌比较，TNBC中AR表达更低，同时，AR的表达与肿瘤分级呈负相关。Hu等[13]对360例TNBC的研究发现，AR的表达与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移及TNM分期无关。本实验研究发现，AR蛋白在Luminal A型中表达最高，在TNBC中表达最低；在组织学I级中表达最高，在III级中表达最低；在临床T1期中表达高于在T2期中的表达；但与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移无关。提示AR参与了乳腺癌的发生和发展，其表达与不同分子分型有关。AR高表达则提示癌组织学分级较低，临床分期较早，预后较好；AR表达下降，组织学分级增高，临床分期越晚，预后越差。

细胞周期调节紊乱是乳腺癌发生最为重要的因素之一。Cyclin D1通过与CDK4/CDK6结合，调控抑癌基因蛋白pRb，激活转录，使细胞从G1期转变到S期，从而推动细胞周期进程。研究显示，在多种肿瘤中发现了Cyclin D1 基因过表达和基因扩增，包括乳腺癌、膀胱癌、甲状旁腺肿瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、肺癌及细胞中心型淋巴瘤等[14]。

研究显示，在乳腺癌组织中，Cyclin D1呈高表达，且与腋窝淋巴结转移数目密切相关，其表达与ER表达呈正相关，与HER2表达呈负相关；Luminal A型乳腺癌所占比例较大；Cyclin D1阳性表达程度越高，患者生存时间越长[15]。王方等[16]研究发现，Cyclin D1的表达与腋窝淋巴结转移密切相关。本实验结果显示，Cyclin D1蛋白在Luminal B型中表达最高，在TNBC中表达最低，在Luminal A型中表达高于在HER2过表达型中的表达；在组织学II级中表达最高，在III级中表达最低；其表达与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期无关。提示在非特殊型浸润性乳腺癌中，Cyclin D1蛋白的表达与肿瘤组织分子分型有关，还与肿瘤组织学分级有关。

研究显示，在乳腺癌细胞中，双氢睾酮激活后的AR通过DAX-1下调Cyclin D1的转录及表达，抑制乳腺癌细胞由G1期进入S期，抑制乳腺癌细胞增殖[17]。但也有研究认为，AR与 Cyclin D1蛋白可能通过同一调节途径，刺激CDK4/6介导的Rb蛋白磷酸化，使Rb蛋白对癌细胞生长的抑制失活，导致正常生长的细胞发生异常增殖；在乳腺组织中，AR与 Cyclin D1蛋白共同参与基因突变，刺激乳腺良性上皮细胞异常增殖、甚至恶性转化，促进乳腺癌的发生[18]。本实验结果显示，AR与Cyclin D1蛋白在TNBC中的表达均较在其余各分子亚型中的表达明显减低，在组织学分级III级中表达均较在Ⅰ、Ⅱ级中的表达明显减低，且AR与Cyclin D1蛋白二者间表达呈正关联。推测AR蛋白过表达可能诱导Cyclin D1蛋白表达增加，从而促进乳腺癌的发生发展；AR与Cyclin D1蛋白异常高表达是非特殊型浸润性乳腺癌发生的早期事件。

综上所述，AR与Cyclin D1蛋白在非特殊型浸润性乳腺癌组织中的阳性表达均与分子分型及组织学分级有关，且均在TNBC、组织学III级癌组织中的表达最低；AR蛋白的表达还与临床分期有关。联合检测AR与Cyclin D1蛋白在非特殊型浸润性乳腺癌不同分子分型组织中的表达情况，可以作为指导临床判断肿瘤组织恶性程度、对患者进行个体化治疗的生物学指标之一。