B群链球菌鉴别培养基的研究

金明哲，吴湘玉

(遵义医学院珠海校区 病原生物学教研室，广东 珠海　519041)

B群链球菌(group Bstreptococcus,GBS)是一种常见的兼性厌氧革兰阳性致病菌，有鞭毛、荚膜结构，主要存在于健康人的直肠和生殖道内，能够引起新生儿败血症、新生儿脑膜炎，新生儿肺炎，以及在孕妇妊娠期间引发各种感染病症[1-2]。美国疾控中心为预防孕妇和新生儿的GBS感染，规定孕妇分娩前必须预防性筛检GBS，目前美国已在很大程度上有效地降低了孕妇围产期GBS的感染率[3-4]。长期以来我国对GBS感染现状重视不够，近期国内报道了一些感染GBS导致死亡的病例。上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院对新生儿早发性血流感染的病原菌进行了检测，显示GBS是导致新生儿败血症最常见的致病菌[5]。

目前用于GBS检测的方法可以分为微生物学检测方法(包括混合血琼脂培养基和Granada培养基)，免疫学检测方法(包括乳胶凝集法、免疫层析法)，分子生物学检测法(包括全细胞荧光原位杂交法、核酸扩增法)[6-7]。尽管培养法比较耗时，但由此获得的纯培养物可以进行药敏试验和进一步分型，故而培养法仍然是GBS快速检测方法需研究的重要部分；而这类方法的核心通常都是利用GBS较为特异的生物学性状，如产生溶血素和色素等重要特征[8-9]。本次研究就是利用GBS在含有血清和淀粉的培养基中可产生橘红色类胡萝卜素的特性[10]，运用简单的实验仪器、实验技术和肉眼观察法，筛选GBS鉴别培养基的最佳配方，并通过干扰试验检测其鉴别培养效果，为GBS的快速检测提供一项简单快速的方法选择。

1　材料与方法

1.1菌株本研究使用的B群链球菌标准菌株ATCC13813、大肠杆菌ATCC25922、白色念珠菌ATCC10231、表皮葡萄球菌ATCC12228、嗜酸乳杆菌ATCC4356、粪肠球菌ATCC29212、绿脓假单胞菌ATCC27853、阴道加德纳菌ATCC14018等，均由珠海美华医疗器械有限公司惠赠。

1.2试剂与仪器可溶性淀粉(天津市永大化学试剂有限公司)；技术琼脂粉(广东环凯微生物技术有限公司)；营养肉汤(青岛高科园海博生物技术有限公司)；精密试纸(上海三爱思试剂有限公司)；恒温培养箱(德国Heraeus公司)。

1.3方法

1.3.1淀粉浓度对GBS鉴别培养基显色反应的影响按表1配方，精密称取各试剂，加水至50.0 mL，混匀成淀粉含量不同的GBS鉴别培养基。

表1不同淀粉浓度的GBS鉴别培养基组成成分表

编号12345678910111213淀粉(g)0.000.250.500.751.001.251.501.752.002.252.502.753.00肉汤(g)0.90.90.90.90.90.90.90.90.90.90.90.90.9琼脂(g)1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0淀粉浓度(%)0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.0

将配制好的培养基，121.3 ℃高压蒸汽灭菌30 min，待培养基温度降至50～60 ℃时，各加入用0.22 μm孔径滤膜过滤的胎牛血清5.0 mL，各培养基血清终浓度为10%，用1.0 mol/L的NaOH和1.0 mol/L的HCl调节培养基的pH 7.0。分装，冷却，制成GBS固体鉴别培养基。置于恒温箱中37 ℃培养24 h，确定无杂菌污染，备用。

采用分区化线分离接种法，在不同淀粉浓度的GBS鉴别培养板上接种GBS菌种，置于37 ℃培养24 h，观察显色情况并记录，确定显色反应最佳的可溶性淀粉浓度为1.0%～2.5%。

1.3.2血清浓度对GBS鉴别培养基显色反应的影响按表1配方比例配制淀粉浓度2.0%的GBS培养基350 mL，分装7瓶，每瓶50 mL，编号1～7。121.3 ℃高压蒸汽灭菌30 min，待培养基温度降至50～60 ℃时，分别向2～7号瓶加入过滤除菌的胎牛血清2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL、4.5 mL、5.0 mL，加血清之前先从2～7号瓶中吸弃欲加血清等量的培养基溶液，使加入血清后的各瓶培养基仍保持50 mL，1号瓶不加胎牛血清。用1.0 mol/L的NaOH和1.0 mol/L的HCl调节培养基的pH 7.0。分装，冷却，制成不同血清浓度的GBS固体鉴别培养基。置于恒温箱中37 ℃培养24 h，确定无杂菌污染，备用。

采用分区化线分离接种法，在不同血清浓度的GBS鉴别培养板上接种GBS菌种，置于37 ℃培养24 h，观察显色情况并记录，确定显色反应最佳的血清浓度为≥7.0%。

1.3.3pH对GBS鉴别培养基显色反应的影响按表1配方比例配制淀粉浓度2.0%的GBS培养基368 mL，121.3 ℃高压蒸汽灭菌30 min，待培养基温度降至50～60 ℃时，加入过滤除菌的胎牛血清32 mL，血清终浓度为8.0%，分装8瓶，每瓶50 mL，编号I～VIII。用1.0 mol/L的NaOH和1.0 mol/L的HCl调节培养基的pH值，I号瓶pH 6.4、II号瓶pH 6.7、III号瓶pH 7.0、IV号瓶pH 7.2、V号瓶pH 7.5、VI号瓶pH 7.7、VII号瓶pH 8.0、VIII号瓶pH 8.5，分装，冷却，制成不同pH的GBS固体鉴别培养基。置于恒温箱中37 ℃培养24 h，确定无杂菌污染，备用。

采用分区化线分离接种法，在不同pH的GBS鉴别培养板上接种GBS菌种，置于37 ℃培养24 h，观察显色情况并记录，确定显色反应最佳的pH为7.2～7.7。

1.3.4杂菌对GBS鉴别培养基显色反应的影响按表1配方比例配制淀粉浓度2.0%的GBS培养基460 mL，121.3 ℃高压蒸汽灭菌30 min，待培养基温度降至50～60 ℃时，加入过滤除菌的胎牛血清40 mL，血清终浓度为8.0%，用1.0 mol/L的NaOH和1.0 mol/L的HCl调节培养基的pH至7.5。分装，冷却，制成GBS固体鉴别培养基。置于恒温箱中37 ℃培养24 h，确定无杂菌污染，备用。

分别将表皮葡萄球菌ATCC12228、粪肠球菌ATCC29212、阴道加德纳菌ATCC14018、嗜酸乳杆菌ATCC4356、白色念珠菌ATCC10231、大肠杆菌ATCC25922、绿脓假单胞菌ATCC27853，单独接种于GBS固体鉴别培养基，置于37 ℃培养24 h，观察记录显色情况。

不同细菌在同一培养基中的代谢产物不同，两种不同代谢产物之间有可能发生反应，为了明确观察GBS鉴别培养基显色反应的各种可能干扰因素，现将上述七种在直肠和生殖道中常见的杂菌与GBS分别作单独干扰试验和混合干扰试验，观察在杂菌干扰情况下，GBS鉴别培养基对GBS的显色反应情况。分别将7种杂菌与B群链球菌标准菌株ATCC13813混合于生理盐水，制成混合菌悬液，编号1～7号管，分别为表皮葡萄球菌、粪肠球菌、阴道加德纳菌、嗜酸乳杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌和绿脓假单胞菌，8号管将7种杂菌和GBS混合于同一试管制成菌悬液。分别从1～8号管，无菌操作取混合菌悬液2～3环，分区划线接种法接种于1.3.4项配制备用的GBS固体鉴别培养基，置于37 ℃培养24 h，观察显色情况并记录。

2　结果

2.1淀粉浓度对GBS鉴别培养基显色反应的影响如表2所示：在无淀粉的培养基中GBS菌落显灰白色；淀粉浓度为0.5%时，GBS微显黄色；淀粉浓度在1.0%～2.5%时，GBS菌落显色效果最好，橙黄色，此阶段的培养基透明度高；淀粉浓度高于3.0%时，随着加入淀粉量的增加，培养基的透明度越发降低，显色效果也越来越差。

表2淀粉浓度对GBS鉴别培养基显色反应的影响

编号12345678910111213淀粉浓度(%)0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.0显色反应-++++++++++++++++++++++++

“-”代表灰白色,“+”代表浅黄色,“++”代表黄色,“+++”代表橙黄色。

2.2血清浓度对GBS鉴别培养基显色反应的影响如表3所示：在无血清时，GBS菌落显灰白色；血清浓度为5.0%时，培养基中GBS菌落呈现浅黄色；血清浓度为6.0%时培养中GBS显色程度加深，呈黄色；血清浓度为7.0%、8.0%、9.0%和10.0%时培养基中GBS显色最明显，呈明亮的橙黄色，且当血清浓度大于7.0%时，GBS显色程度不随血清浓度的增加而更显著。

表3血清浓度对GBS鉴别培养基显色反应的影响

编号1234567血清浓度(%)0.05.06.07.08.09.010.0显色反应-+++++++++++++++

“-”代表灰白色,“+”代表浅黄色,“++”代表黄色,“+++”代表橙黄色。

2.3pH对GBS鉴别培养基显色反应的影响如图1所示：pH 6.4时，GBS菌落为灰白色；pH 6.7时，GBS菌落微显黄色，似有还无；pH 7.0时，GBS菌落显黄色；当GBS鉴别培养基的pH为7.2～7.7时，培养中GBS显色明显加深，呈橙黄色；pH 8.0时，GBS菌落显色较前减弱，呈浅黄色；当pH 8.5时，GBS显色进一步减弱呈微黄色。

图1　pH对GBS鉴别培养基显色反应的影响

2.4单一杂菌在GBS鉴别培养基上的显色反应如图2所示：表皮葡萄球菌、粪肠球菌、阴道加德纳菌、嗜酸乳杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌在GBS鉴别培养基上的菌落颜色均呈灰白色或浅黄色，绿脓假单胞菌在GBS鉴别培养基上的菌落颜色呈浅绿色，上述几种菌落颜色与此培养基上的典型GBS菌落的橙黄色有显著性差异。

A:表皮葡萄球菌；B：粪肠球菌；C：阴道加德纳菌；D：嗜酸乳杆菌；E：白色念珠菌；F：大肠杆菌；G：绿脓假单胞菌；H：GBS。图2　单一杂菌在GBS鉴别培养基上的显色反应结果

2.5杂菌干扰试验结果如图3所示：图中标号1～6，分别是表皮葡萄球菌、粪肠球菌、阴道加德纳菌、嗜酸乳杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌，这6种杂菌的单独干扰试验，在1～6号培养基上都能观察到明显的橙黄色菌落；7号培养基是绿脓假单胞菌的干扰试验，因绿脓假单胞菌分泌铜绿色素，故在7号培养基1区细菌密集生长处，GBS的显色被干扰，不易发现，但在7号培养基3区还是能观察到GBS的橙黄色单个菌落；8号培养基，七种在人类直肠和生殖道中常见的杂菌和GBS都有生长，在8号培养基1区细菌密集生长处，GBS的显色也被绿色干扰，不易发现橙黄色，但在8号培养基3区同样能观察到GBS的橙黄色单个菌落。

图3　杂菌干扰试验结果

3　讨论

据统计国内GBS感染主要集中于孕妇、新生儿两类群体，而在非孕妇成年人群体中引发感染相对较少。由于GBS在携带者体内不会出现任何症状，只有通过必要的检测，才能判断人体内是否携带有这种细菌，因此对于孕妇而言，对其进行GBS筛检显得尤为重要。目前GBS快速检测法也有抗原检测法和核酸检测法，但这两种方法对仪器设备以及操作人员有严格的技术要求[11-13]，不易推广。因此简便快速的GBS鉴别培养法成为GBS筛检研究的重点和热点。

本研究根据GBS与淀粉反应呈现类胡萝卜素的特性，在培养基中加入不同浓度的可溶性淀粉、不同浓度的血清及不同的pH值，培养繁殖B群链球菌标准菌株，观察培养基的显色反应，从而确定当可溶性淀粉浓度在1.0%～2.5%，血清浓度≥7.0%，pH为7.2～7.7时，GBS固体鉴别培养基上的B群链球菌显色反应最明显，呈现的特异性颜色为橙黄色。由于临床中待检的GBS标本中一定会有直肠或生殖道中的其他杂菌污染，所以用直肠和生殖道中常见的杂菌进行干扰试验，观察干扰菌是否影响GBS在鉴别培养基上的显色反应，以此检测GBS鉴别培养基的特异性鉴别作用。实验结果显示，表皮葡萄球菌、粪肠球菌、阴道加德纳菌、嗜酸乳杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌、绿脓假单胞菌等直肠和生殖道中常见的杂菌，在GBS鉴别培养基上的菌落颜色分别呈现灰白色或浅黄色或浅绿色，与GBS菌落的橙黄色有显著性差异；且杂菌与GBS混合培养后，在可观察分散菌落处，GBS的橙黄色菌落仍可被轻松地观察到，不会被其他杂菌干扰。

综上所述，由本研究可知：可溶性淀粉浓度1.0%～2.5%，血清浓度≥7.0%，pH为7.2～7.7的GBS固体鉴别培养基适用于B群链球菌的检测，且操作简便、特异性高。